Caracterización bioquímica y genética de endoxilanasas secretadas por Trichoderma sp. nativos de Misiones para su utilización en el proceso de pretratamiento

Abstract

El aprovechamiento de fuentes alternativas de energía es una de las prioridades del plan de desarrollo estratégico de la Argentina. La utilización del residuo bagazo de caña de azúcar se presenta como una alternativa para la producción de combustibles de segunda generación siendo necesaria la optimización del pretratamiento de la biomasa. Las endoxilanasas secretadas por numerosos microorganismos, dentro de los que se destacan los pertenecientes al género Trichoderma, hidrolizan el xilano de la hemicelulosa permitiendo la liberación de azúcares de cinco carbonos fermentables y facilitando la exposición de la fibra de celulosa para su hidrólisis en la etapa de sacarificación. El objetivo de esta tesis fue seleccionar cepas nativas de la provincia de Misiones para la optimización de la producción de xilanasas y profundizar en las características bioquímicas y genéticas de estas enzimas, para evaluar su potencial biotecnológico en el pretratamiento de bagazo de caña de azúcar. En primer lugar, se realizó un screening cualitativo de 20 cepas de Trichoderma sp. disponibles en el laboratorio, de las cuales 11 resultaron positivas para endoxilanasa. Luego para la cuantificación de la actividad enzimática de las cepas seleccionadas se realizaron cultivos en medio líquido, 5 de ellas presentaron los máximos niveles de actividad. Seguidamente se evaluó la actividad endoxilanolítica de estas cinco cepas en medio de cultivo suplementado con bagazo de caña de azúcar y se seleccionó a la cepa identificada como T. atroviride LBM 117 como la más promisoria por mostrar el nivel más alto de actividad endoxilanolítica y con mayor termoestabilidad enzimática a 30 C. Las concentraciones de bagazo de caña y de las 3 fuentes de nitrógeno del medio Mandels fueron optimizadas, logrando un 15% de incremento en los niveles de actividad. El análisis bioeconómico realizado mostró que la producción de endoxilanasa es más rentable en comparación al xilano en estas condiciones. En paralelo se obtuvo una secuencia génica estructural compuesta por 720 pb, que se traduce en 219 aminoácidos. Se corroboró la similitud con secuencias disponibles en las bases de datos lo que arrojó una identidad del 97% con T. atroviride (XM 014082116.1). Se logró reutilizar la enzima e incrementar su termoestabilidad respecto a la enzima libre, al inmovilizarla en agar- agar con un rendimiento de la actividad enzimática del 97 %. En lo que hace referencia al efecto de diferentes aditivos sobre la actividad, se vio que el cobalto inhibió la actividad tanto de la libre como de la inmovilizada, en cambio el EDTA y el zinc mejoraron la actividad de la enzima inmovilizada un 30%. Por último, se realizó la evaluación del potencial xilanolítico de la enzima nativa y comercial tanto libre como inmovilizada sobre la bioconversión del bagazo de caña de azúcar pretratado con NaOH. Los mayores niveles de azúcares reductores se obtuvieron en el ensayo con la endoxilanasa libre nativa. Luego del proceso de sacarificación de este material se vislumbró que el pretratamiento enzimático permitió la obtención de un 60 % más de azúcares reductores que podrían estar disponibles para la fermentación. Convirtiéndose en una estrategia promisoria para su aplicación en la producción de bioetanol.

The exploitation of alternative sources of energy is one of the priorities of the strategic development plan of Argentina. The use of sugarcane bagasse is an alternative for the production of second generation fuels in which the optimization of the biomass pretreatment become necessary. Secreted microbial endoxylanases, particularly those belonging to the genus Trichoderma, hydrolyze the xylan of the hemicellulose which allows the release of five carbon sugars and facilitates the exposure of the cellulose fibers for their hydrolysis in the saccharification step. The objective of this PhD thesis was to select native strains from the province of Misiones to optimize the endoxylanase production and study biochemical and genetic characteristics of these enzymes to evaluate their biotechnological potential in the pretreatment of sugarcane bagasse. In first place, a qualitative screening of 20 Trichoderma strains was carried out and 11 of them were endoxylanase producers. Their enzyme activity quantification was carried out in liquid culture medium where 5 of them showed the highest enzyme levels. Endoxylanase activity produced by these 5 strains in culture medium with sugarcane bagasse was then evaluated, and T. atroviride LBM 117 was selected since it showed the highest endoxylanase activity and the best enzyme thermostability at 30 ºC. The concentrations of sugarcane bagasse and the three nitrogen sources presented in Mandels medium were optimized reaching an improvement of 15% enzyme activity levels. Bioeconomic analysis showed that endoxylanase production in these conditions is more rentable than using commercial xylan. Moreover, it was obtained a structural genic sequence of 720 bp which was translated into 219 amino acids, and was compared to sequences available in databases corroborating a 97% identity with T. atroviride (XM 014082116.1). Furthermore, the reuse of the endoxylanase and its thermostability improvement was possible by immobilizing it in agar-agar with an 97% enzyme activity yield. In regard to the effect of different additives on the endoxylanase activity was found that cobalt inhibited the activity of both free and immobilized enzyme whereas EDTA and zinc improved 30% activity of the immobilized enzyme. Lastly, the evaluation of the xylanolytic potential of both free and immobilized native and commercial enzymes was carried out on the NaOH pretreated sugarcane bagasse bioconversion, and the highest levels of reducing sugars were obtained applying the native free endoxylanase. After the saccharification of this material, it was concluded that the enzymatic pretreatment yielded 60% more reducing sugars which could be available for fermentation, being a promising strategy for its application in the process of bioethanol production.