Caracterización de celulasas secretadas por aislamientos de trichoderma, nativos de la provincia de Misiones (Argentina) aplicables en la etapa de sacarificación

Abstract

La bioconversión de biomasa lignocelulósica en azúcares monoméricos, mediante la acción de enzimas celulasas, es la etapa más lenta y costosa del proceso de obtención de biocombustibles de 2da generación, y se convierte en la principal dificultad económica que obstaculiza el aprovechamiento rentable de esta abundante fuente de energía. Misiones es una región muy biodiversa y favorable para la búsqueda de nuevos microorganismos fúngicos. El género Trichoderma, es uno de los mejores secretores de celulasas. Aislar y caracterizar nuevos aislados microbianos nativos capaces de secretar celulasas con alto rendimiento, como también conocer sus características bioquímicas y moleculares, aportarían soluciones innovadoras para la aplicación de esta tecnología. Atendiendo a esta necesidad, el OBJETIVO GENERAL del presente proyecto fue caracterizar bioquímica y molecularmente nuevos sistemas enzimáticos hidrolíticos a partir de aislamientos de Trichoderma, nativos de la provincia de Misiones, seleccionados en base a su óptima capacidad de secreción de celulasas para su aplicación en la etapa de sacarificación. Para evaluar la capacidad secretora de celulasas cualitativa y cuantitativamente, se partió de 28 aislamientos de Trichoderma, de los cuales se seleccionaron los tres aislamientos más promisorios. Los aislados se identificaron a nivel de especie mediante la amplificación molecular de la región ITS1-5,8S-ITS2 del ADNr; el aislamiento POS7 se identificó como T. koningiopsis, y los aislamientos NAN13 y TEYU14 se identificaron como T. harzianum. Con el fin de optimizar las variables operativas para la secreción de celulasas utilizando sustratos lignocelulósicos en cultivos SSF, se seleccionaron las fuentes de carbono y nitrógeno a través de un análisis de varianza. Para POS7, la mayor actividad enzimática se detectó con bagazo de caña de azúcar, y para NAN13 y TEYU14, con cascarilla de arroz. Respecto a las fuentes de nitrógeno, el mayor incremento en la actividad enzimática se detectó con el complejo nitrogenado Mandels. Una vez seleccionado el medio Mandels, mediante un diseño de superficie de respuesta (RSM), se optimizaron sus tres principales componentes nitrogenados (urea, extracto de levadura y sulfato de amonio), y mediante un nuevo diseño de RSM, se optimizaron diferentes parámetros físico-químicos (relación masa/volumen, % de humedad y pH del medio). A partir de una metodología de fermentación adecuada y un diseño experimental eficaz, fue posible optimizar la secreción sinérgica del complejo celulasas y particularmente de cada una de las enzimas del mismo. POS7 presentó la máxima secreción de celulasas (en U/L), seguido de TEYU14 y de NAN13. Para evaluar la prospección biotecnológica de las enzimas secretadas, se realizaron ensayos de sacarificación enzimática del material lignocelulósico pretratado bajo diferentes condiciones de pretratamiento químico y diversos tiempos de reacción. Se observó que hubo diferencias significativas entre el control (sin pretratar) y todas las combinaciones de pretratamiento-sacarificación ensayadas. Para bagazo de caña de azúcar, la condición que presentó diferencias significativas frente a las demás, fue el ensayo con NaOH al 3% llevado a 121°C y 1 atm de presión superior a la normal durante 50 min; mientras que para cascarilla de arroz, fueron los ensayos con H2SO4 al 0,42% durante 29 min y al 1,98% durante 71 min, ambos llevados a 121°C y 1 atm de presión superior a la normal. Optimizado el cultivo en SSF, se evaluó la estabilidad de la actividad enzimática post-fermentación en el tiempo, y a diferentes temperaturas y pH de reacción. Se observó notable estabilidad enzimática en el tiempo, pero con pérdidas significativas a T° por debajo y encima de los 50°C, y en menor medida a diferentes pH de reacción. Así mismo, se determinó la presencia de isoenzimas para cada una de las enzimas del complejo celulasas. Finalmente, se buscó obtener un fragmento génico de las enzimas del complejo, mediante el diseño de cebadores degenerados. Para NAN13 la amplificación por PCR permitió obtener un fragmento génico de 372 pb con una identidad máxima del 95% con el gen cbhI de T. harzianum, sirviendo de punto de partida para la obtención de la secuencia génica reguladora y estructural del gen cbh1 en POS7, por tanto estas secuencias pudieron reconocerse como nuevos miembros de las CBHs en aislamientos del género Trichoderma nativos de la provincia de Misiones (Argentina).

The bioconversion of lignocellulosic biomass into monomeric sugars, by the action of cellulase enzymes, is the slowest and most expensive step in the production of second generation biofuels, and it becomes the main economic problem hindering the profitable use of this abundant source of energy. Misiones has a very rich biodiversity forest region for searching new fungal microorganisms. The genus Trichoderma, is one organism that most secrete cellulases. Isolation and characterization of new native fungal strains able to secrete cellulases, as well as their biochemical and molecular knowledge, will provide innovative solutions for the application of this technology. The main objective of this project was the biochemical and molecular characterization of new hydrolytic enzyme systems from Trichoderma, native of the province of Misiones, based on their cellulases production for their application in the saccharification step. We evaluate qualitatively and quantitatively the cellulases secretory capacity of 28 isolates of Trichoderma, of which were selected three the most promising isolates. The isolates were molecularly identified to species level by amplification of the ITS1-5,8S-ITS2 DNAr region; the isolate POS7 was identified as T. koningiopsis, and the isolates NAN13 and TEYU14 were identified as T. harzianum. In order to optimize operating variables for secretion of cellulases using lignocellulosic substrates in cultures SSF, were selected sources of carbon and nitrogen through an analysis of variance. For POS7, the higher enzyme activity was detected with sugarcane bagasse, and for NAN13 and TEYU14, with rice husk. Related to the nitrogen sources, the greatest increase in enzyme activity was detected with Mandels nitrogenous compound. By a response surface design (RSM) it was possible to optimize the proportion of urea, yeast extract and ammonium sulfate (the three major nitrogen components) of the Mandels medium. Using another RSM it was possible to optimize different physicochemical parameters (mass/volume relation, % moisture and pH of the medium). Based on this methodology of fermentation and experimental design it was possible to optimize the synergic secretion of cellulases complex and each of the enzymes of the cellulases complex separately. The fungal strain POS7 presented the maximum secretion of cellulases (U/L), followed by TEYU14 and NAN13. To evaluate the biotechnological prospection of the enzymes secreted were performed assays of enzymatic saccharification of pre-treated lignocellulosic material by different chemical pretreatment conditions and different reaction times. There were observed statistically significant differences between control (no pretreat) and all combinations pretreatment-saccharification tested. In the case of sugarcane bagasse, the condition that presented significant differences compared to others was with 3% NaOH pretreated at 121°C and 1 atm of pressure for 50 min; while for rice hulls the condition that presented significant differences compared to others were the test with 0.42% H2SO4 for 29 min and with 1.98% H2SO4 for 71 min, both pretreated at 121°C and 1 atm of pressure. After culture optimization in SSF, the stability of the post-fermentation enzyme activity was evaluated in the time and in different temperatures and pH of reactions. Remarkable enzyme stability it was observed over the time, but with significant losses of stability with temperatures below and above 50°C. Different pH reactions affected the stability of the post-fermentation enzyme activity to a lesser degree compared to time and temperature. Also, the presence of isozymes for each of the enzymes of the cellulase complex was determined. Finally, there were designed degenerate primers to obtain a gene fragment of the enzymes. PCR amplification using the designed primers amplified a 372 bp gene fragment for NAN13 with a maximum of 95% identity with the cbhI gene of T. harzianum. This gene fragment was employed for obtain the regulatory and structural gene sequences of cbh1 gene in POS7. Therefore these sequences were recognized as new members of the CBHs in Trichoderma isolates native of the province of Misiones (Argentina).