Aspectos bioquímicos y moleculares de celobiohidrolasas fúngicas con potencial aplicación en el proceso de sacarificación

Abstract

Las prácticas agrícolas generan desperdicios lignocelulósicos compuestos por celulosa, hemicelulosas y lignina que pueden ser bioconvertidos por hongos para generar productos de valor agregado como los biocombustibles. En este sentido, las enzimas celulolíticas como las endoglucanasas, celobiohidrolasas y β-glucosidasas se presentan como una alternativa para su utilización en la hidrólisis de celulosa a azúcares que pueden ser fermentados a etanol. El objetivo general de esta tesis fue obtener un medio enriquecido en celobiohidrolasas a partir del cultivo de hongos políporos nativos de Misiones (Argentina) con características propicias para ser utilizados en el proceso de sacarificación, un paso clave en la producción de bioetanol. En un screening inicial, se evaluó el potencial celulolítico de 14 políporos mediante ensayos cualitativos seleccionándose 11 aislamientos que mostraron actividad endoglucanasa, celobiohidrolasa y β-glucosidasa. Luego, se realizó un screening cuantitativo en cultivos sumergidos y se seleccionó el aislamiento LBM 033 por presentar los mayores títulos de actividad enzimática para las tres celulasas. Además, los sobrenadantes de cultivo de cada aislamiento mostraron diferentes perfiles isoenzimáticos, correspondiendo la mayoría de las bandas a 45 kDa para las celobiohidrolasas y a un rango entre 69 y 88 kDa para las endoglucanasas. El aislamiento LBM 033 fue identificado como Trametes villosa mediante el uso de los marcadores ITS y rbp2 y la construcción de árboles. La celulosa cristalina, la peptona y el sulfato de amonio afectaron (P≤0,01) a la actividad celobiohidrolasa, obteniéndose la mayor actividad enzimática luego de 12 días de cultivo. Las condiciones del medio se estandarizaron, obteniéndose el valor óptimo de 49±5 U/l en las siguientes condiciones: 15 g/l de celulosa cristalina y 3 g/l de peptona y sulfato de amonio. El sobrenadante de cultivo estandarizado de T. villosa LBM 033 presentó el mayor valor de actividad celobiohidrolasa a 60°C y pH 4, 8. La termoestabilidad fue mayor a 30ºC seguida de 50ºC, disminuyendo a temperaturas más elevadas, mientras que la actividad enzimática fue más estable a los pHs 4, 8 y 10. El sobrenadante presentó además títulos elevados de otras actividades enzimáticas necesarias para la hidrólisis de los sustratos holocelulósicos, hidrolizando los sustratos artificiales celulósicos hasta celobiosa y glucosa. En la sacarificación del residuo de cebada pretratatado por extrusión, el porcentaje de sacarificación de la holocelulosa fue del 30 %, representado probablemente por oligosacáridos reductores. En el análisis del secretoma se logró identificar una CBHII. Además, el 66 % de las proteínas estuvieron relacionadas con la bioconversión de la biomasa lignocelulósica. Estos resultados indican que los macrohongos de Misiones, como T. villosa LBM 033 pueden constituir una valiosa fuente de celulasas, especialmente celobiohidrolasas que pueden aplicarse en la etapa de sacarificación lo que podría reducir el costo total de la producción de bioetanol.