Extracción enzimática de polisacáridos de interés regional en la provincia de Misiones

Abstract

Las enzimas pecticas o pectinasas constituyen el único grupo de enzimas que catalizan la degradación de las sustancias pécticas presentes en la pared celular de plantas superiores. Según su modo de acción se clasifican en: poligalacturonasas (PGasas), liasas (pectinliasa (PL) o pectatoliasa (PAL)) y pectinesterasa (PE). Las PGasas y liasas son enzimas depolimerizantes, rompen los enlaces glicosídicos α-(1,4) entre los monómeros de los ácidos galacturónicos de las sustancias pécticas, ya sea por un mecanismo de hidrólisis (PGasas) o por un mecanismos de β eliminación (PL y PAL). PE cataliza la desesterificación de los grupos metoxilos de las moléculas de pectina, formando ácido péctico. Las pectinasas son ampliamente utilizadas en el procesamiento industrial de frutas y vegetales porque disminuyen la viscosidad de los jugos y facilitan los procesos de extracción, maceración, licuefacción y clarificación. Wickerhamomyces anomalus, es una levadura autóctona, aislada a partir de frutas cítricas en la Provincia de Misiones, Argentina, que produce una poligalacturonasa (PGasa) en forma extracelular. Esta enzima es de gran importancia industrial ya que es capaz (a diferencia de otras PGasas) de desintegrar tejidos de mandioca cruda, liberando los gránulos de almidón del interior de las células; y de liberar pectina de tejidos vegetales. En la presente Tesis Doctoral se plantearon dos etapas claramente diferenciadas pero concatenadas, una dedicada a la producción de la PGasa por W. anomalus; y otra en la cual se utilizaron los sobrenadantes de dichos cultivos en el proceso de extracción enzimática de polisacáridos de interés regional (almidón de mandioca y pectina cítrica). Parte A: Optimización de la producción de la enzima PGasa por W. anomalus. 1. Se optimizaron las condiciones de cultivo para la producción de PGasa a partir de W. anomalus. Las fermentaciones se realizaron inicialmente, en un medio de referencia (MR) compuesto por glucosa, pectina cítrica, sulfato de amonio, vitaminas, aminoácidos, KH2PO4, MgSO4, CaCl2 y micronutrientes (Mo+2, Cu+2, Fe+3, Mn+2 y Zn+2), a escala frascos agitados, a 30°C, 180 rpm, durante 16 h. Se evaluó el efecto de las condiciones de cultivo: temperatura de incubación (30 a 40 °C), pH (4,5 a 6,5) y velocidad de agitación (150 a 250 rpm) sobre la producción de PGasa. Se aplicó inicialmente un diseño factorial 23 y posteriormente la metodología de superficie de respuesta. El pH y la temperatura influyeron significativamente en la producción de la enzima PGasa, mientras que la influencia de la velocidad de agitación fue no significativa. Los mayores títulos se obtuvieron a 30°C y pH de 5,1; con un valor máximo de actividad PGasa de 18,84 UE/mL. 2. Se estudió la influencia de la composición de los componentes del medio de cultivo sobre la producción de PGasa, en busca de un medio económico y de simple preparación. El efecto de la fuente de nitrógeno (FN) y de los elementos traza, se estudió por el método de un factor por vez. Según el análisis de varianza no hubo diferencias significativas entre los valores de síntesis de PGasa con urea o sulfato de amonio como fuente de nitrógeno. El pH se mantuvo ~4,0 en el transcurso del proceso fermentativo al utilizar urea como FN, a diferencia de lo observado en el medio que contenía sulfato de amonio, en el cual el pH disminuyo hasta 2,6 luego de 16 h. Se decidió utilizar urea como FN para los estudios posteriores. La ausencia de elementos traza en el medio de referencia tuvo un efecto represivo sobre la síntesis enzimática. Posteriormente, se aplicó el diseño experimental de Plackett-Burman (PB) para evaluar el efecto en el MR, de la pectina comercial, extracto de levadura, presencia/ausencia de elementos traza, Fe+2, Ca+2, Mg+2 y PO4HK2, los factores significativos y con efecto positivo se optimizaron por el método de superficie de respuesta (MSR). Del diseño experimental de PB, resultó que la pectina y el extracto de levadura influyeron positivamente sobre la producción de PGasa, mientras que el Ca+2 influyó de manera negativa. Mediante la MSR se observó un aumento en la producción de la enzima hasta una concentración de 0,75 g/L de extracto de levadura y 6 g/L de pectina, alcanzando valores de PGasa de ~ 25,5 U/mL. El medio de cultivo optimizado quedo compuesto de la siguiente manera: glucosa 10 g/L; pectina cítrica comercial 6 g/L; urea 1,4 g/L; extracto de levadura 0,75 g/L; PO4HK2 0,5 g/L; CaCl2 0,05 g/L; MgSO4 0,25 g/L. 3. Se estudió la producción enzimática a escala bioreactor, en las condiciones y con el medio de cultivo optimizados en las etapas anteriores, mediante dos sistemas de cultivo: tipo batch y tipo batch alimentado. Se utlizó un biorreactor de 5 L conteniendo 3 L de medio, a 30 ºC, 550 rpm, con suministro de aire estéril. Mediante el cultivo batch, W. anomalus creció en fase exponencial hasta las 10 h de cultivo. La glucosa se agotó cuando el cultivo alcanzó la fase de crecimiento estacionario. La biomasa producida condujo a un rendimiento de biomasa (Yx/s) de 0.30 gx/gs. Se calculó una tasa de crecimiento específica máxima (μm) de 0.164 h−1 (R2: 0.92). La síntesis de PGasa pareció estar asociada al el crecimiento de la levadura, alcanzando 25.52 ± 0.147 UE/mL al final del cultivo. El pH se mantuvo en valores cercanos a 4.0 en el curso del proceso. Durante el crecimiento de W. anomalus, usando cultivo tipo batch alimentado a caudal constante (F= 60 mL/h), se observó un incremento en la expresión de la enzima. La actividad PGasa obtenida fue de 48.93 ± 0.38 UE/mL, correspondiente a una productividad de 3.19 UE/mLh. 4. Se optimizó otro medio de cultivo utilizando residuos agroindustriales. Los residuos agroindustriales se caracterizaron por la determinación de su composición centesimal, y el contenido de pectina. Las fermentaciones se realizaron en el medio de referencia (MR), a escala frascos agitados, a 30°C, 150 rpm, durante 16 h. Se evaluó el uso de ocho residuos agroindustriales crudos (residuos de cáscara de naranja, limón, banana, pomelo, maracuyá, ananá y mamón) como inductores de la producción de PGasa de W. anomalus, en lugar de pectina de citrus comercial, por el método de un factor por vez. El residuo de limón, fue el mejor inductor para la producción de PGasa por W. anomalus, se obtuvo una actividad relativa de 5.09 % superior (21.735UE/mL) a la obtenida en el MR. Posteriormente se aplicó el diseño experimental de Plackett-Burman, para evaluar los siguientes factores: residuo agroindustrial seleccionado, Ca+2, Mg+2 y PO4HK2, presencia/ausencia de extracto de levadura, aminoácidos, elementos traza y Fe+2. Los cultivos realizados en el MR, con pectina de citrus comercial como inductor, fueron considerados como control. El diseño Plackett-Burman mostró que el residuo de limón, Mg+2 y PO4HK2 tuvieron un efecto significativo en la producción de PGasa. El efecto de las otras variables (extracto de levadura, Ca+2, Fe+2, aminoácidos y solución de elementos traza) no fue significativo. Los factores significativos y positivos (Mg+2 y PO4HK2) se mantuvieron en su nivel más alto. Las otras variables no significativas (extracto de levadura, Ca+2, Fe+2, aminoácidos y solución de elementos traza), se omitieron y la pectina comercial se reemplazó por el residuo de limón. A continuación, se empleó un método de superficie de respuesta, utilizando el diseño experimental de Doehlert, para encontrar la concentración óptima del residuo de limón y el tiempo de fermentación, para la producción de la enzima. La síntesis de la enzima aumentó cuando la concentración del residuo de limón disminuyó del 10% (p/v) al 2% (p/v). A medida que el tiempo de fermentación aumentó de 3 a 12 h, se observó una mayor producción de PGasa. Se obtuvo un valor máximo de PGasa de 30.06 ± 1.27 UE/mL, en el medio con 2% (p/v) de residuo de limón a las 12 h de cultivo. El nuevo medio de cultivo optimizado, conteniendo residuo agroindustrial como inductor quedó compuesto de la siguiente manera: glucosa 10 g/L; residuo de limón 2 % p/v; urea 1,4 g/L; PO4HK2 0,5 g/L; MgSO4 0,25 g/L; solución de vitaminas 1000X. La producción de la enzima en este medio optimizado se realizó a escala biorreactor, mediante sistema tipo batch. La producción detectable de PGasa comenzó a las 2 h, obteniendo una producción máxima a las 12 h, la que coincidió con el agotamiento de la glucosa. A partir de este momento, la actividad enzimática en el sobrenadante del cultivo se mantuvo constante. Se obtuvo una producción enzimática máxima de 31,28 ± 0,93 UE/ml a las 12 h. Parte B. Aplicación del extracto enzimático de W.anomlaus en procesos tecnológicos de interés regional. 1. Se puso a punto un protocolo para la extracción enzimática de almidón a partir de mandioca cruda, utilizando los sobrenadantes del cultivo de W. anomalus (extracto enzimático – EE). Para el proceso de extracción, la mandioca pelada y cortada, se colocó en frascos Erlenmeyers a los que se les agregó el EE y buffer de reacción. La mezcla se incubó a 40ºC, durante 6 h, en una incubadora con agitación y posteriormente se filtró. El filtrado, denominado material extraído (ME), se centrifugó, lavó y secó a 45°C hasta peso constante. Se estudiaron diferentes factores sobre el rendimiento del proceso extractivo: tamaño de tejido (bastones, cubos, láminas, rallado y triturado);dosis de la enzima (15, 30 y 45 mL); relación sólido/líquido (g/mL) (30:20, a 30:100); temperatura (30 a 50°C) y tiempo de extracción (1 a 6 h), a los efectos de encontrar las condiciones óptimas que permitan alcanzar los mayores rendimientos de producto. La mandioca “procesada (MP)” permitió un mayor rendimiento de extracción. Los blancos con el EE inactivo arrojaron valores despreciables. Los mayores rendimientos de almidón se obtuvieron con una relación sólido/líquido de 30:60 g/mL. La dosis de enzima, influyó significativamente en el rendimiento del proceso extractivo, los mayores rendimientos resultaron con un volumen del EE de 30 mL (PGasa en el medio de reacción: ~15,5 UE/mL). Posteriormente, se optimizó la temperatura y tiempo de extracción, utilizando metodología de superficie de respuesta, según el diseño experimental de Doehlert. El óptimo rendimiento de extracción de almidón se presentó a 40°C y 5 h de extracción. La ecuación polinomial de segundo orden determinó un valor máximo de extracción de almidón de 32,57 ± 0,41 % (p/p). Al realizar la extracción a escala reactor, en las condiciones optimizadas, se obtuvo un rendimiento de 33,06 ± 0,49 % (p/p). El protocolo final de extracción resultó ser: mandioca cruda, lavada y procesada (MP) + EE (relación S/L 30/60 – PGasa = 15 UE/mL), incubación (40 °C, 5 h, 400 rpm), filtración, lavado (2 veces), sedimentación y descarte sobrenadante, secado, molido y tamizado. 2. Se evaluaron las características químicas y funcionales del almidón extraído por vía enzimática (AE) y se comparó con el del almidón comercial (AC). EL AE presentó contenidos de humedad, proteína, fibra cruda y grasa levemente mayores a los que presentó el AC. El contenido de cenizas y carbohidratosdel AE, resultó ligeramente menor al de AC y estos valores estuvieron dentro de los parámetros exigidos por el Código Alimentario Argentino. El mayor índice de solubilidad en agua (% ISA) y poder de hinchamiento (PH) se presentó a los 70 °C en ambos almidones. El PH del AE presentó un valor ligeramente menor respecto al del AC, siendo los valores obtenidos de 1,97 gagua/gAE y 2,08 gagua/gAC, para AE y AC, respectivamente. Dichos valores se encuentran dentro del rango de referencia establecido por la Food and Agriculture Organization (FAO, 2007). Respecto a los valores de ISA, el AC no presentó diferencia significativa en comparación con el AE (3,14% y 3,97% respectivamente). El AE presentó una temperatura de empastamiento (comienzo de la gelatinización) de 63,5 ºC, un pico de viscosidad máxima de 355 UB, la viscosidad de la pasta a los 95 ºC fue de 352,5 UB, la estabilidad de la pasta durante la cocción (breakdown) fue de 132,5 UB y la tendencia a la retrogradación (setback) fue de 80 UB. La sinéresis debido a la refrigeración y congelación de las pastas de AE fue más alta respecto a la del AC. Esto implica que la pasta de AE resultó ser menos estable a ambos procesos que la de AC. Los valores de transmitancia (%T) obtenidos fueron de 52,32%T para AE, semejante al obtenido para AC (55,17%T). La pasta de AE es considerada una paste clara o transparente. La temperatura de gelificación resultante para AE fue de 63°C. El AE podría ser utilizado en alimentos como mermeladas, gelatinas, y en confitería para la elaboración de gomitas, etc. 3. Se puso a punto un protocolo para la extracción enzimática de pectina a partir de residuos de limón, utilizando los sobrenadantes del cultivo de W. anomalus. El proceso de extracción de pectina se realizó en frascos Erlenmeyers conteniendo albedo de limón, buffer de reacción y el extracto enzimático crudo de W. anomalus. La mezcla se incubó a 30ºC, durante 6 h, con agitación, pH 5,0, y luego se centrifugó. El material polimérico obtenido, se precipitó con etanol y el peso seco del gel obtenido se denominó material insoluble en etanol (MIE). El rendimiento de extracción de pectina se reportó como g de MIE por cada 100 g de albedo seco. Los factores evaluados fueron: relación sólido/líquido (1:20, 1:40, 1:50 y 1:60), actividad enzimática (3,125, 6,25, 12,5 y 25 mL), temperatura (30 a 50°C) y tiempo de extracción (1 a 8 h). Estos rendimientos se compararon con la pectina obtenida utilizando un método químico. Los mejores rendimientos de MIE (35,93± 0,67 % (p/p)) se obtuvieron con una relación sólido/líquido de 1/50, 12,5 mL del EE (actividad PGasa en el medio de reacción: 4,28 UE/mL), 40ºC, 4 h y pH 5,0. Este valor fue superior al obtenido utilizando el método químico. La pectina se determinó como la cantidad de ácido galacturónico (AGA) solubilizado, por el método del m-hidroxidifenilo. Se caracterizó mediante la determinación del grado de esterificación (GE), empleando el método titulométrico; y la capacidad de gelificación en un producto alimenticio mediante la elaboración de una mermelada. Se observó que los rendimientos obtenidos en el presente estudio empleando el EE de W. anomalus fueron mayores a los obtenidos por el método químico y con la enzima comercial. El grado de esterificación de la pectina extraída fue del 79,10 %, siendo una pectina HM. La riqueza en ácido galacturónico (AGA) de la pectina extraída fue del 82,57 %, indicando que la misma es lo suficientemente pura. La pectina extraída presentó buena capacidad gelificante.