Extracción de pectina de albedo de limón mediante enzimas pécticas producidas por una levadura autóctona

Abstract

El objetivo del presente trabajo de tesis fue poner a punto la extracción de pectina a partir de albedo de limón, por vía enzimática, mediante una poligalacturonasa producida, en medio líquido, por Wickerhamomyces anomalus, una levadura aislada en la Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales de la Universidad Nacional de Misiones. En la primera etapa se obtuvo el extracto enzimático, para ello se realizaron cultivos de W. anomalus, en un medio de cultivo sintético (MS) compuesto por glucosa, pectina de citrus, sulfato de amonio, otras sales, aminoácidos y vitaminas, con agitación y aireación. Los cultivos se realizaron a escala de frascos agitados, los que fueron incubados a 30 ºC, a 180 rpm, hasta 24 h. Se evaluó la influencia de las vitaminas y los aminoácidos sobre el crecimiento y la producción de la enzima. Finalizada la etapa de fermentación, el cultivo fue centrifugado y el sobrenadante, denominado extracto enzimático (EE), se utilizó como fuente de enzima extracelular. En la segunda etapa se evaluó la aplicación del EE en la extracción enzimática de pectina a partir de albedo de limón. Para ello, inicialmente, se puso a punto el protocolo de extracción enzimática, posteriormente se estudió el efecto de diferentes factores tales como el pH, la relación sólido-líquido, la temperatura, el tiempo de extracción y la concentración de enzima. Se comparó el rendimiento del proceso extractivo por vía enzimática con el método de extracción química. Finalmente se caracterizó parcialmente la pectina extraída. El crecimiento de W. anomalus fue despreciable en ausencia de biotina, pantotenato de calcio, piridoxina o tiamina, estas 4 vitaminas resultaron esenciales para lograr un buen desarrollo de la levadura y por lo tanto una buena producción de la enzima de interés. La omisión de los aminoácidos (triptófano, histidina y metionina) en el medio MS produjo una disminución en la producción de PG. Se obtuvieron valores de producción de PG de 49,896 ± 1,35 UE/mL, en el medio MS, conteniendo únicamente las 4 (cuatro) vitaminas, a las 8 h de cultivo. El pH, la relación sólido/líquido, y la concentración del extracto enzimático, influyeron significativamente en la extracción de pectina a partir de albedo de limón, utilizando el EE de W. anomalus. Los mayores rendimientos se obtuvieron a pH 4,5, con una relación sólido/líquido de 1/50 y utilizando 12,5 mL del extracto enzimático. El VI rendimiento de extracción de pectina aumentó con el tiempo de reacción, a todas las temperaturas estudiadas. Los rendimientos obtenidos a 35 y 40 ºC fueron superiores respecto a los obtenidos a 30 y 50 ºC. Para 35 ºC, el rendimiento de extracción de pectina alcanzó un valor máximo de 36,86 ±0,575 % p/p (g MIE/100 g albedo seco) a las 6 h de reacción. Para 40 ºC, se obtuvo un rendimiento de 36,540 ± 0,960 % p/p (g MIE/100 g albedo seco) a las 4 h de reacción. Se concluyó que los rendimientos obtenidos en el presente estudio empleando el EE de W. anomalus fueron mayores a los obtenidos por el método químico, lo cual confirma la bondad del proceso enzimático utilizado.

The aim of this thesis was the development of enzymatic pectin extraction from lemon albedo by a polygalacturonase produced in liquid medium by Wickerhamomyces anomalus, a yeast isolated in the Chemical and Natural Sciences Faculty of National University of Misiones. In the first step the enzyme extract was obtained, for this W. anomalus cultures were performed in a synthetic culture medium (MS) consisting of glucose, citrus pectin, ammonium sulfate, other salts, aminoacids and vitamins with stirring and aeration. Cultures were performed to scale shake flasks, which were incubated at 30 °C, 180 rpm, up to 24 h. The influence of vitamins and aminoacids on growth and enzyme production were evaluated. After the fermentation stage, the culture was centrifuged and the supernatant, denominated enzyme extract (EE), was used as source of extracellular enzyme. In the second stage, the EE application in the enzymatic pectin extraction from lemon albedo was evaluated. For this purpose, the enzyme extraction protocol was first developed and then, the effect of different factors such as pH, solid-liquid ratio, temperature, extraction time and enzyme concentration were studied. Enzymatic extraction process was compared with the chemical extraction method. Finally the extracted pectin was characterized. W. anomalus growth was negligible in the absence of biotin, calcium pantothenate, pyridoxine or thiamine, these four vitamins were essential for a good development of the yeast and therefore a good production of the enzyme of interest. The omission of the amino acids (tryptophan, histidine and methionine) in the MS medium resulted in a decrease of PG production. PG production values of 49,896 ± 1,35 EU/mL were obtained in MS medium containing only the 4 (four) essential vitamins, at 8 h of culture. The PH, solid/ liquid ratio, and the concentration of enzyme extract, significantly influenced the extraction of pectin from lemon albedo with the EE of W. anomalus. The highest yields were obtained at pH 4,5, with a solid / liquid ratio of 1/50 and using 12,5 mL of the enzyme extract. The pectin extraction yield increased with reaction time, at all temperatures studied. The yields obtained at 35 and 40 °C were higher than those obtained at 30 and 50 °C. For 35 °C, the extraction yield of pectin reached a maximum value of 36,86 ± 0,575 % w/w (g MIE/100 g dry albedo) at 6 h of reaction. For 40 °C, a yield of 36,54 ± 0,960 % w/w (g MIE/100 g dry albedo) was obtained at 4 h reaction. It was concluded that the yields obtained in the present study using the EE W. anomalus were higher than those obtained by the chemical method, which confirms the goodness of the enzymatic process used.