Evaluación de la actividad antifúngica in vitro de extractos acuosos de Ilex paraguariensis St. Hil. (Yerba mate) frente a Candida spp., aisladas de pacientes con candidiasis vulvovaginal

Abstract

La candidiasis vulvovaginal (CVV) es una patología del tracto genital femenino causada por levaduras, principalmente pertenecientes al género Candida. La especie aislada con mayor frecuencia es Candida albicans, seguida de Candida glabrata, aunque en los últimos años se observa un aumento en la frecuencia de aparición de otras especies no - C. albicans. Esta micosis permanece sin resolución, aun en los tiempos que corren, y se vuelve recurrente debido a fallas en los tratamientos. Aunque la CVV no está asociada a mortalidad, su elevada morbilidad la convierte en una de las principales causas de alteración en la vida sexual, afectiva y psicológica de las mujeres. La CVV no resuelta puede complicarse en enfermedad inflamatoria pélvica, infertilidad, embarazo ectópico, absceso pélvico, aborto espontáneo y trastornos menstruales, lo que implica también costos económicos directos e indirectos. A pesar de contar con distintas drogas antifúngicas para el tratamiento de esta micosis, no siempre son efectivas, se suele desarrollar resistencia postratamiento. En general, los antifúngicos presentan efectos colaterales e indeseables, lo que conlleva a restricciones de uso en determinadas pacientes. La búsqueda de nuevas moléculas es un área de investigación en expansión. En este sentido, el uso de productos naturales obtenidos de plantas se presenta como una alternativa potencial, ya que en distintos estudios se evidencia menor toxicidad y en algunos casos, actividad antifúngica de amplio espectro. La perspectiva de obtener un antifúngico etnofarmacológico natural y económico, con escasos o nulos efectos secundarios es un desafío a futuro. La planta de Ilex paraguariensis St Hilarie, llamada popularmente “yerba mate” se produce y cultiva en Misiones y nordeste de Corrientes, Paraguay, sur de Brasil y Uruguay. La planta fue utilizada por los aborígenes que conocían sus numerosas virtudes, ya que formaba parte de sus hábitos y su dieta, la consumían como estimulante natural y por sus propiedades medicinales. En las hojas de la planta se encuentra un alto contenido de componentes bioactivos: saponinas, polifenoles y xantinas. Se le atribuyen propiedades antioxidantes, anticarcinogénicos, hipoglucemiante, antiobesidad, hipocolesterolémicos,antihipertensivos, cardioprotectores, antiinflamatorios, antibacterianos, antifúngicos, antivirales y antiparasitarios, entre los más estudiados. Teniendo en cuenta las propiedades de la yerba mate como antimicrobiano, en este trabajo nos planteamos como objetivo: determinar y comparar la actividad antifúngica in vitro de extractos acuosos obtenidos de hojas de I. paraguariensis y de antifúngicos convencionales frente a especies de Candida aisladas de pacientes con CVV. Se trabajó con una muestra de 139 cepas de hongos levaduriformes aislados de CVV de mujeres en edad reproductiva, residentes en la Ciudad de Posadas, Misiones. Las levaduras fueron identificadas fenotípica y molecularmente. Se evaluó la sensibilidad in vitro mediante la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y por difusión en agar, de acuerdo a los documentos de referencia EDef. 7.3.2 del EUCAST y M44 3er ed. del CLSI, respectivamente. Se evaluaron los antifúngicos fluconazol, itraconazol, clotrimazol y nistatina, y extractos acuosos de yerba mate (EAHYM). Para los ensayos por difusión en agar se utilizaron discos y tabletas comerciales cargados con antifúngicos y cargados con EAHYM en el laboratorio. Se calcularon los porcentajes de concordancia entre el método de referencia por dilución y el método por difusión en agar para las combinaciones antifúngico/levadura que contaban con puntos de corte clínicos. Se obtuvo la siguiente distribución de especies en orden de frecuencia: C. albicans sensu stricto, C. grabrata sensu stricto, C. tropicalis, C. parapsilosis sensu stricto, C. nivariensis, C. metapsilosis, C. krusei y Saccharomyces cerevisiae. Con las técnicas fenotípicas no fue posible identificar a las especies crípticas. Para C. albicans y C. tropicalis, el antifúngico más activo fue el fluconazol con un 94,6 % y 83,3 % de cepas sensibles, respectivamente. Mientras que para C. parapsilosis el 100 % resultó sensible al itraconazol y el 66,7 % fue sensible al fluconazol. Para el clotrimazol y la nistatina no fue posible categorizar a los aislados debido a que aún no se definieron puntos de corte clínico. El clotrimazol inhibió el desarrollo del 92,8 % de las cepas en estudio con un valor de CIM ≤ 0,06 µg/mL, mientras que la nistatina inhibió al 100 % de las cepas con un valor de CIM ≤ 2 µg/mL. Para S. cerevisiae, se obtuvieron valores bajos de CIM para el itraconazol y el clotrimazol, ≤0,25 µg/mL y ≤0,06 µg/mL, respectivamente. Mientras que para el fluconazol y la nistatina los valores de CIM fueron ≤4 µg/mL y ≤2 µg/mL, respectivamente. Al evaluar el fluconazol, los porcentajes de concordancia con C. albicans y C. tropicalis, tanto con los discos, como con las tabletas, fueron en promedio un 86,1 % para los tres reactivos. El menor porcentaje de concordancia fue para las especies del complejo C. glabrata con un 67 %, 33,3 % y 75 % para las tabletas, disco Malbrán y disco Oxoid, respectivamente. Con las especies del complejo C. parapsilosis el porcentaje de concordancia fue relativamente bajo, 75 %, 50 % y 50 %, para las tabletas, disco Malbrán y disco Oxoid, respectivamente. El mayor porcentaje de discrepancias muy mayores con fluconazol se obtuvo con los discos Malbrán para las especies no-C. albicans (22,2 %), seguido por los discos Oxoid (13,8 %). Para el itraconazol, el porcentaje de concordancia fue del 75 % a excepción de C. tropicalis que mostró un 100 % de discrepancias menores. Con respecto al EAHYM, se observó un rango amplio de valores de CIM para las especies de Candida (0,78 mg/mL a 400 mg/mL). Mientras que para S. cerevisiae la inhibición se alcanzó con valores de CIM ≤ 6,25 mg/mL. No obtuvimos resultados satisfactorios cuando evaluamos a los EAHYM por difusión en agar. A la fecha, comunicamos el primer aislamiento de las especies crípticas C. nivariensis y C. metapsilosis de como agentes de vulvovaginitis en Argentina. Pudimos comprobar que existe actividad inhibitoria in vitro del EAHYM frente a especies de Candida y S. cerevisiae. Este trabajo constituye un primer aporte al conocimiento de la actividad inhibitoria de EAHYM sobre especies de Candida y S. cerevisiae aisladas de pacientes con vulvovaginitis y evaluada por un método de referencia. Comprobamos la potencial utilidad de este producto vegetal de importancia regional y nos alienta a continuar trabajando en esta línea de investigación.

Vulvovaginal candidiasis (CVV) is a pathology of the female genital tract caused by yeasts, mainly belonging to the genus Candida. The most frequently isolated species is Candida albicans, followed by Candida glabrata, although in recent years there has been an increase in the frequency of appearance of other non-C. albicans species. This mycosis remains without resolution, even in current times, and becomes recurrent due to treatment failures. Although CVV is not associated with mortality, its high morbidity makes it one of the main causes of alteration in sexual, affective and psychological life in women. Unresolved CVV can be complicated by pelvic inflammatory disease, infertility, ectopic pregnancy, pelvic abscess, spontaneous abortion, and menstrual disorders, which also entail direct and indirect economic costs. Despite having different antifungal drugs for the treatment of this mycosis, they are not always effective, post-treatment resistance usually develops. In general, antifungals present undesirable side effects, which leads to restrictions on their use in certain patients. The search for new molecules is an expanding research area. In this sense, the use of natural products obtained from plants is presented as a potential alternative, since different studies show less toxicity and in some cases, broad spectrum antifungal activity. The prospect of obtaining a natural and inexpensive ethnopharmacological antifungal with few or no side effects is a future challenge. The Ilex paraguariensis St.Hilarie plant, popularly called “yerba mate”, is produced and cultivated in Misiones and northeast of Corrientes, Paraguay, southern Brazil and Uruguay. The plant was used by the aborigines who knew its many virtues, since it was part of their habits and their diet; they consumed it as a natural stimulant and for its medicinal properties. There is a high content of bioactive components in the leaves of the plant: saponins, polyphenols and xanthines. Antioxidant, anticarcinogenic, hypoglycemic, antiobesity, hypocholesterolemic, antihypertensive, cardioprotective, anti-inflammatory, antibacterial, antifungal, antiviral and antiparasitic properties are attributed to it, among the most studied. Taking into account the properties of yerba mate as an antimicrobial, in this study we set ourselves the objective: to determine and compare the in vitro antifungal activity of aqueous extracts obtained from leaves of I. paraguariensis and conventional antifungals against Candida species isolated from patients with CVV. We worked with a sample of 139 strains of yeast fungi isolated from CVV from women of reproductive age, residing in the city of Posadas, Misiones. Yeasts were phenotypically and molecularly identified. In vitro, sensitivity was evaluated by determining the minimum inhibitory concentration (MIC) and by diffusion in agar, according to the reference documents EDef. 7.3.2 of the EUCAST and M44 3rd ed. of the CLSI, respectively. The antifungals fluconazole, itraconazole, clotrimazole and nystatin, and aqueous extracts of yerba mate (EAHYM) were evaluated. Commercial disks and tablets loaded with antifungal and loaded with EAHYM were used in the laboratory for agar diffusion tests. The percentages of agreement between the dilution reference method and the agar diffusion method were calculated for antifungal / yeast combinations that had clinical cutoff points. The following distribution of species was obtained in order of frequency: C. albicans sensu stricto, C. grabrata sensu stricto, C. tropicalis, C. parapsilosis sensu stricto, C. nivariensis, C. metapsilosis, C. krusei and Saccharomyces cerevisiae. Using phenotypic techniques, it was not possible to identify cryptic species. For C. albicans and C. tropicalis, the most active antifungal was fluconazole with 94.6% and 83.3% of susceptible strains, respectively. While for C. parapsilosis el 100% was sensitive to itraconazole and 66.7% was sensitive to fluconazole. For clotrimazole and nystatin it was not possible to categorize the isolates because clinical cut-off points have not yet been defined. Clotrimazole inhibited the development of 92.8% of the study strains with a MIC value ≤ 0.06 µg / mL, while nystatin inhibited 100% of the strains with a MIC value ≤ 2 µg / mL. For S. cerevisiae, low MIC values were obtained for itraconazole and clotrimazole, ≤ 0.25 µg / mL and ≤ 0.06 µg / mL, respectively. While for fluconazole and nystatin the MIC values were ≤ 4 µg / mL and ≤ 2 µg / mL, respectively. When evaluating fluconazole, the percentages of agreement with C. albicans and C. tropicalis, both with the discs and with the tablets, averaged 86.1% for the three reagents. The lowest percentage of agreement was for the species of the complex C. glabrata with 67 %, 33.3 % and 75 % for the tablets, Malbrán disk and Oxoid disk, respectively. With the species of the complex C. parapsilosis the percentage of concordance was relatively low, 75 %, 50 % and 50 %, for the tablets, Malbrán disk and Oxoid disk, respectively. The highest percentage of much larger discrepancies with fluconazole was obtained with Malbrán discs for non-C albicans species. (22.2 %), followed by Oxoid discs (13.8%). For itraconazole, the percentage of agreement was 75 % with the exception of C. tropicalis which showed 100 % minor discrepancies. With respect to EAHYM, a wide range of MIC values was observed for Candida species (0.78 mg / mL a 400 mg / mL). While for S. cerevisiae, inhibition was achieved with MIC values ≤ 6.25 mg / mL. We did not obtain satisfactory results when we evaluated EAHYM by agar diffusion. To the date, we report the first isolation of the cryptic species C. nivariensis and C. metapsilosis from as agents of vulvovaginitis in Argentina. We were able to verify that there is in vitro inhibitory activity of EAHYM against Candida species and S. cerevisiae. This work constitutes a first contribution to the knowledge of the inhibitory activity of EAHYM on Candida species and S. cerevisiae isolated from patients with vulvovaginitis and evaluated by a reference method. We verify the potential utility of this plant product of regional importance and it encourages us to continue working in this line of research.