Caracterización citogenética, reproductiva y fitoquímica de Amaryllidaceae

Abstract

Las especies de Amarilidáceas nativas de Argentina son de interés por su atractivo ornamental y su capacidad de síntesis de alcaloides específicos de uso medicinal actual y potencial. Para la utilización de estos recursos genéticos y la conservación de germoplasma de interés, es importante conocer previamente el sistema genético, la fertilidad y los modos de reproducción. Estas plantas tienen follaje y flores de diversos tamaños, formas, colores, y gran adaptabilidad a diferentes condiciones climáticas, de cultivo y de escalas de producción. Además, entre los alcaloides naturales que producen estas especies, se encuentra la galantamina, actualmente conocida como un potente inhibidor de acetilcolinesterasa (AChE) en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Ambos aspectos les confieren un alto valor como posibles nuevos cultivos. En esta tesis se describe el nivel de ploidía, la fertilidad, la citoembriología y los modos de reproducción de Habranthus brachyandrus e Hippeastrum striatum y se reporta el perfil fitoquímico de los alcaloides que sintetizan ambas especies. También se analizaron los perfiles de alcaloides producidos de Habranthus pedunculosus y Zephyranthes mesochloa y con los extractos de alcaloides obtenidos de las cuatro especies se hicieron pruebas de actividad biológica sobre la acetilcolinesterasa. Simultáneamente, se efectuaron ensayos de poliploidización sintética a partir de semillas de Habranthus brachyandrus, H. robustus y bulbillos de Hippeastrum striatum. Finalmente, se analizó la regeneración vegetativa con la intención de optimizar la multiplicación del material vegetal de interés. En el capítulo I se describe que las accesiones analizadas de Habranthus brachyandrus resultaron tetraploides, con invariablemente 2n = 4x = 24 cromosomas en todos los individuos estudiados. Además, se reporta que la viabilidad promedio del polen es 99%, el Índice de Fertilidad estimado mediante la producción de semillas es IF=0,63 y se comprueba la existencia de autogamia. El poder germinativo promedio de las semillas de H. brachyandrus fue de PGx=96%. Los análisis citoembriológicos en óvulos maduros y la citometría de flujo en semillas, indicaron presencia de reproducción sexual. Por su parte, en Hippeastrum striatum, se encontraron accesiones diploides con 2n = 2x = 22 cromosomas y pentaploides con 2n = 5x = 55 cromosomas. La viabilidad de polen fue de 74% en diploides y 69% en pentaploides. En esta especie solo una accesión diploide produjo semillas, con un Índice de Fertilidad de IF=0,20 en cambio los pentaploides son estériles. El poder germinativo promedio fue de PGx=29%. Los análisis citoembriológicos en óvulos maduros revelaron que los sacos embrionarios se originan por vía sexual. La citometría de flujo en semillas confirmó la vía sexual para el origen de esas semillas. En el capítulo II se describe la abundancia relativa de 18 compuestos del Extracto Enriquecido en Alcaloides (EEA) de Habranthus brachyandrus, 18 compuestos en el EEA de H. pedunculosus, 28 alcaloides conocidos y 4 compuestos no identificados en el EEA de Hippeastrum striatum y 12 compuestos en el EEA de Zephyranthes mesochloa. Simultáneamente, se observó que el extracto de Habranthus brachyandrus mostró inhibición leve hacia AChE con valor CI50 de 164,27 μg / mL, el de H. pedunculosus no mostró actividad inhibitoria, el de Hippeastrum striatum mostró inhibición moderada con un valor CI50 de 29,81 μg / mL y el de Z. mesochloa mostró una fuerte inhibición hacia AChE con un valor CI50 de 4,36 μg / mL. En el capítulo III, se presentan los bulbos mixoploides obtenidos de Habranthus brachyandrus, H. robustus e Hippeastrum striatum, los cuales se caracterizan por ser prolíficos para desarrollar bulbillos con la misma condición mosaico. Por último, en el capítulo IV, se reseñan los experimentos acerca de cómo el corte del bulbo madre induce la producción de bulbillos en Habranthus brachyandrus y la incrementa en un 87,5% en Hippeastrum striatum. Las especies analizadas son un recurso genético nativo, útil para la aplicación de biotecnologías y cuyas características les confieren un alto valor como posibles nuevos cultivos, que originen productos naturales, con potencial para el aprovechamiento en el mercado mundial de las flores y la industria farmacéutica.

The native Amaryllidaceae species from Argentina are of interest for their ornamental attractiveness and their ability to synthesize specific alkaloids, which have current and potential medicinal value. The real use of these genetic resources in germplasm conservation projects need a genetic system, fertility and modes of reproduction characterization. Amaryllidaceae plants have foliage and flowers of different sizes, shapes, colors, and great adaptability to different climatic conditions and also cultivation and production scales. In addition, among the alkaloids produced by these species, galantamine is currently known as a potent acetylcholinesterase (AChE) inhibitor used in the Alzheimer’s disease treatment. In the present thesis the ploidy level, fertility, cytoembryology and reproduction modes of Habranthus brachyandrus and Hippeastrum striatum are described and, the phytochemical profile of the alkaloids synthesized by both species is also reported. The profiles of alkaloids produced by Habranthus pedunculosus and Zephyranthes mesochloa are also analyzed. Alkaloid extracts obtained from the four mentioned species, were experimental testing searching biological activity on acetylcholinesterase. Simultaneously, synthetic polyploidization essays were carried out starting from seeds in Habranthus brachyandrus, H. robustus and starting from bulblets in Hippeastrum striatum. Finally, methods for vegetative regeneration of plant material of interest were analyzed. In chapter I, the chromosome number and reproductive features are described. All the analyzed accessions of Habranthus brachyandrus were invariably tetraploid, with 2n = 4x = 24 chromosomes in all the studied individuals. In addition, it is reported that the average pollen viability is 99%, the mean Fertility Index estimated through seed production is IF = 0.63, and it was proved the existence of autogamy. The average germination power of H. brachyandrus seeds was PGx = 96%. Cytoembryological analyzes in mature ovules and flow cytometry in seeds indicated sexual reproduction in tetraploid H. brachyandrus. On the other hand, in Hippeastrum striatum, diploid accessions with 2n = 2x = 22 chromosomes and pentaploids with 2n = 5x = 55 chromosomes were found. Pollen viability was 74% in diploids and 69% in pentaploids. In this species only one diploid accession produced seeds, with a Fertility Index of IF = 0.20, whereas the pentaployds are sterile. The average germination power was PGx = 29%. Cytoembryological analyzes in mature diploid ovules indicated sexual reproduction for this cytotype. Chapter II describes the relative abundance of 18 compounds in the Alkaloid Enriched Extract (AEE) of Habranthus brachyandrus; 18 compounds in the AEE of H. pedunculosus; 28 known alkaloids and 4 unidentified compounds in the AEE of Hippeastrum striatum, and 12 compounds in the AEE of Zephyranthes mesochloa. Simultaneously, it was observed that extracts of Habranthus brachyandrus showed mild inhibition towards AChE with an IC50 value of 164.27 μg / mL, those of H. pedunculosus did not show inhibitory activity with an IC50 value > 200 μg / mL, those of Hippeastrum striatum showed moderate inhibition with an IC50 value of 29.81 μg / mL and those of Z. mesochloa showed a strong inhibition towards AChE with an IC50 value of 4.36 μg / mL. In chapter III, the mixoploid bulbs obtained from Habranthus robustus, H. brachyandrus and Hippeastrum striatum are presented and are characterized asprolific to develop daughter bulblets with the same mosaic condition. Finally, in chapter IV, it is described how cutting the mother bulb induces the production of daughter bulblets in Habranthus brachyandrus and increases it by 87.5% in Hippeastrum striatum. The analyzed species are a native genetic resource, useful for the application of biotechnologies and whose characteristics give them a high value as possible new crops, which give origin to natural products with potential use in the world flower market and the pharmaceutical industry.