Producción de biopelícula y actividad in vitro de una solución saturada de sacarosa en levaduras del complejo Candida parapsilosis

Abstract

Dentro de las levaduras del género Candida, el complejo Candida parapsilosis también denominado Candida parapsilosis sensu lato, son levaduras ubicuas y forman parte de la microbiota normal de piel humana. En base a la heterogeneidad hallada en las regiones ITS1, ITS2 y la secuencia de ADN ribosomal 5,8s (ADNr), se determinó que este complejo está integrado por levaduras genotípicamente diferentes, y se las denominó C. parapsilosis s.s. (grupo I), C. orthopsilosis (grupo II), y C. metapsilosis (grupo III). Un factor de patogenicidad especialmente significativo del complejo es la formación de biopelículas. Esta forma de vida, en comunidades adheridas a superficies protege a las mismas del sistema inmunitario y aumenta su resistencia a la acción de los antifúngicos; lo que en consecuencia conlleva, a la posible persistencia de la infección y potencial permanencia del foco de infección. Ante esta situación, la posibilidad de uso de formulaciones alternativas tales como una solución saturada de sacarosa, eugenol y polietilenglicol, representa una alternativa promisoria y de la cual no hay experiencia en el estado del arte sobre su acción biocida sobre estas comunidades microbianas y sus formas planctónicas. Los objetivos de esta tesis fueron establecer la frecuencia de especies crípticas de las cepas clínicas identificadas originalmente como del complejo C. parapsilosis y evaluar la capacidad de formación de biopelículas, in vitro; y determinar la bioactividad in vitro de una SSS, sobre las formas sésiles y sobre las formas planctónicas del complejo C. parapsilosis. La estrategia metodológica utilizada fue un diseño descriptivo, experimental, transversal y cuantitativo; y se esgrimió un estudio retrospectivo con un trabajo de campo. Se analizaron 54 cepas identificadas originalmente por métodos fenotípicos, como complejo C. parapsilosis provenientes de aislamientos de muestras clínicas, depositadas en la colección de de la Cátedra de Micología de la Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales (FCEQyN) de la Universidad de Misiones (UNaM), entre 01 de Febrero de 2014 a 31 de Julio 2018. Las muestras fueron del tipo no probabilísticas escogidas en forma ocasional. Se utilizó la secuenciación de la región ITS1-5,8S- ITS2 para la identificación molecular de cepas catalogadas como complejo C. parapsilosis. Se determinó la capacidad de formación de biopelículas in vitro en placas de microtitulación de fondo plano y se determinó cuantitativamente el grado de formación de biopelícula, con un lector de Elisa a 490 nm. Se evaluó la sensibilidad in vitro a SSS, cualitativamente en tubo para las formas planctónicas y cuantitativamente en placas de microtitulación para las formas sésiles. En la población analizada, la frecuencia de las distintas especies que integran el complejo C. parapsilosis fue: C. parapsilosis s.s. (grupo I) en una frecuencia del 85% (45/53), C. metapsilosis (grupo III) en un 11% (6/53) y C. orthopsilosis (grupo II) en un 4% (2/53). Tras la identificación genotípica por secuenciación, una cepa resultó ser C. guilliermondii identificada erróneamente debido a que en su momento solo se utilizaron métodos fenotípicos. El 68% (36/53) de la levaduras del complejo C. parapsilosis desarrolló biopelícula. De las 45 cepas de C. parapsilosis s.s., 32 mostraron capacidad de formación de biopelículas in vitro, lo que representa el 71% (32/45), de las cuales el 13% (6/32) presentaron un porcentaje de bloqueo de + (una cruz); el 22% (10/32) exhibieron un porcentaje de bloqueo de ++ (dos cruces) y el 36% (16/32) ponderó un porcentaje de bloqueo +++ (tres cruces). C. metapsilosis formó biopelículas, lo hizo en un 33% (2/6) y se cuantificó un porcentaje de ++ (dos cruces) El 100% (2/2) de C. orthopsilosis tuvo la capacidad de desarrollarlas y se midió un porcentaje de bloqueo (tres cruces). Se analizó la bioactividad de la SSS sobre las formas planctónicas. No hubo desarrollo de ninguna de las cepas del complejo C. parapsilosis, que estuvieron en contacto con la SSS por 12 h. La viabilidad de las cepas se comprobó con subcultivos en agar glucosa Sabouraud 20. Tampoco se detectó desarrollo en las cepas testigo ATCC 22019, DMic 14837 y DMic 134539. La SSS fue efectiva in vitro sobre las formas sésiles tras el contacto por 24 h con la solución de ensayo, sobre las cepas del complejo C. parapsilosis con capacidad de formar biopelículas. Se determinó que dentro del complejo C. parapsilosis mantenidas en la colección de cepas de la FCEQyN (UNaM), la especie predominante fue C. parapsilosis s.s., seguida de C. metapsilosis y C. orthopsilosis. Los datos de cuantificación mostraron que la mayoría de las cepas de C. parapsilosis s.s. formaban una capa de biopelícula variable con predominio de entramados más densos. Las dos cepas de C. metapsilosis formaron biopelículas densas, mientras que en C. orthopsilosis, la densidad de la biopelícula varió. La SSS resultó ser efectiva sobre las formas planctónicas y sobre las biopelículas de cepas del complejo C. parapsilosis.

Within the yeasts of the genus Candida, the Candida parapsilosis complex, also called Candida parapsilosis sensu lato, are ubiquitous yeasts and are part of the normal microbiota of human skin. Based on the heterogeneity found in the ITS1, ITS2 regions and the 5.8s ribosomal DNA sequence (rDNA), it was determined that this complex is composed of genotypically different yeasts, and they were named C. parapsilosis s.s. (group I), C. orthopsilosis (group II), and C. metapsilosis (group III). An especially significant pathogenicity factor of the complex is the formation of biofilms. This way of life, in communities adhered to surfaces, protects them from the immune system and increases their resistance to the action of antifungals; which consequently leads to the possible persistence of the infection and potential permanence of the infection focus. Given this situation, the possibility of using alternative formulations such as a saturated solution of sucrose, eugenol and polyethylene glycol, represents a promising alternative. There is no previous experience in the state of the art on the biocidal action on these microbial communities and their planktonic forms. The objectives of this thesis were to establish the frequency of cryptic species of the clinical strains originally identified as the C. parapsilosis complex and to evaluate the biofilm formation capacity, in vitro; and to determine the in vitro bioactivity of an SSS, on the sessile forms and on the planktonic forms of the C. parapsilosis complex. The methodological strategy used was a descriptive, experimental, transversal and quantitative design; and a retrospective study was supported with a field work. Fifty four strains originally identified by phenotypic methods, such as C. parapsilosis complex from isolates of clinical samples, were analyzed. They were deposited in the collection of the Chair of Mycology of the Faculty of Exact Chemical and Natural Sciences (FCEQyN) of the University of Misiones (UNaM), between February 1st, 2014 and July 31st, 2018. The samples were of the non-probabilistic type occasionally chosen. Sequencing of the ITS1- 5.8S-ITS2 region was used for the molecular identification of strains tagged as C. parapsilosis complex. The vitro biofilm formation capacity was determined in flat bottom microtiter plates and the degree of biofilm formation was quantitatively determined with an Elisa reader at 490 nm. In vitro sensitivity to SSS was evaluated, qualitatively in tubes for planktonic forms and quantitatively in microtiter plates for sessile forms. In the analyzed population, the frequency of the different species that integrate the C. parapsilosis complex was: C. parapsilosis s.s. (group I) in a frequency of 85% (45/53), C. metapsilosis (group III) in a 11% (6/53) and C. orthopsilosis (group II) in 4% (2/53). After genotypic identification by sequencing, one strain turned out to be C. guilliermondii, misidentified because only phenotypic methods were used at the time. 68% (36/53) of the yeasts of the C. parapsilosis complex developed biofilm. Of the 45 strains of C. parapsilosis s.s., 32 showed in vitro biofilm formation capacity, which represents 71% (32/45), of which 13% (6/32) presented a blocking percentage of + (a cross); 22% (10/32) exhibited a +++ block percentage (two crosses) and 36% (16/32) weighted a +++ block percentage (three crosses). C. metapsilosis formed biofilms in 33% (2/6) and a percentage of ++ (two crosses) was quantified. The whole C. orthopsilosis, 100% (2/2, had the ability to develop biofilms and a blocking percentage (three crosses) was measured. The bioactivity of SSS on planktonic forms was analyzed. There was no development of any of the strains of the C. parapsilosis complex, which were in contact with the SSS for 12 h. The viability of the strains was verified with subcultures on Sabouraud 20 glucose agar. No growth was detected in the control strains ATCC 22019, DMic 14837 and DMic 134539. SSS was effective in vitro on sessile forms on strains of the C. parapsilosis complex with the ability to form biofilms, after being in contact for 24 h with the test solution, It was determined that within the C. parapsilosis complex maintained in the FCEQyN (UNaM) collection of strains, the predominant species were C. parapsilosis s.s., followed by C. metapsilosis and C. orthopsilosis. The quantification data showed that most of the strains of C. parapsilosis s.s. formed a variable biofilm layer with a predominance of denser webs. The two strains of C. metapsilosis formed dense biofilms, while in C. orthopsilosis, the density of the biofilm varied. SSS was found to be effective on planktonic forms and on biofilms of strains of the C. parapsilosis complex.