Producción de xilanasas a partir de Aspergillus nativos de Misiones (Argentina) y su potencial aplicación en la hidrólisis de residuos agroindustriales

Abstract

Las industrias agroforestales en el mundo generan residuos lignocelulósicos que pueden ocasionar grandes problemas de polución. Estos residuos pueden aprovecharse como bajo el concepto de biorrefinería empleándose como materia prima de biocombustibles de segunda generación y como fuentes de carbono para el crecimiento de microorganismos y producción de cócteles enzimáticos. En esta tesis doctoral, se utilizaron residuos lignocelulósicos provenientes de las industrias agro-forestales locales de la provincia de Misiones (Argentina) para producir enzimas xilanasas a partir de hongos del género Aspergillus y también para llevar a cabo ensayos de hidrólisis enzimática para futura producción de bioetanol de segunda generación. En primera instancia, se aislaron hongos del género Aspergillus de Misiones y se evaluaron en función de su capacidad xilanolítica y proteolítica encontrándose dos aislamientos promisorios con actividad xilanasa alta y actividad proteasa baja, LBM 055 y LBM 134. Posteriormente, se evaluó el efecto del bagazo de caña de azúcar, bagazo de mandioca, aserrín de pino y aserrín de eucaliptus sobre la actividad endoxilanasa de ambos aislamientos seleccionados, eligiéndose el aislamiento LBM 134 por presentar mayores niveles de endoxilanasas cuando el hongo creció con bagazos. Este aislamiento se identificó de manera contundente como Aspergillus niger mediante un enfoque polifásico. A. niger LBM 134 alcanzó niveles de endoxilanasas máximos de 110 UmL-1 y 160 UmL-1 cuando creció en medio con bagazo de caña de azúcar y mandioca, respectivamente, luego de optimizar las fuentes de nitrógeno en ambos medios de cultivo y las variables físicas de inoculación e incubación. Asimismo, la producción de endoxilanasas en estos medios resultó ser 20 veces más económica que producir la misma utilizando medio de cultivo con xilano comercial. Los cócteles enzimáticos optimizados de A. niger LBM 134 se caracterizaron mediante análisis secretómico y se confirmó la capacidad de bioconversión del hongo ya que ambos secretomas presentaron una expresión diferencial de las enzimas encargadas de degradar los componentes carbonados de la pared celular vegetal. El secretoma del hongo crecido en medio optimizado con bagazo de caña de azúcar mostró un incremento de la cantidad de xilanasas mientras que, en el secretoma del hongo crecido en bagazo de mandioca se observó celulasas, amilasas y pectinasas en mayor cantidad. Por otra parte, los cócteles enzimáticos optimizados de A. niger LBM 134 se aplicaron en la hidrólisis de bagazo de caña de azúcar y de mandioca, obteniéndose niveles de azúcares fermentable superiores a los obtenidos con enzimas comerciales. Esto concluye que los niveles de actividad xilanasa y celulasa fueron suficientes para hidrolizar enzimáticamente los bagazos de caña de azúcar y de mandioca.

Agroforestry industries in the world generate lignocellulosic residues that can cause huge pollution problems. These residues can be exploited under the biorefinery concept as raw material for second generation biofuels and as carbon sources for microorganism’s growth and enzyme production. In this PhD thesis, lignocellulosic residues from local agroforestry industries from Misiones (Argentina) were used to produce xylanase enzymes from Aspergillus fungi to carry out the enzymatic hydrolysis for future production of second-generation bioethanol. Firstly, Aspergillus fungi were isolated from Misiones and were evaluated based on their xylanolytic and proteolytic capacity, being LBM 055 and LBM 134 the most promising isolates with high xylanase activity and low protease activity. Then, the effect of sugarcane bagasse, cassava bagasse, pine sawdust and eucalyptus sawdust on endoxylanase activity of both chosen isolates was evaluated. The isolate LBM 134 was selected due to the higher levels of endoxylanases when it grew with the bagasses and was identified as Aspergillus niger through a polyphasic approach. After the optimization of nitrogen sources and physical variables, A. niger LBM 134 reached the highest levels of endoxylanases, 110 UmL-1 and 160 UmL-1, when it grew in media with sugarcane and cassava bagasse, respectively. These endoxylanase levels were 20 times cheaper than reaching the same enzyme levels with culture medium using commercial xylan. Optimized enzyme cocktails from A. niger LBM 134 were characterized by a secretomic analysis and the bioconversion capacity of the fungus was confirmed since both secretomes showed a differential expression of enzymes involved in the degradation of carboned components of vegetal cell walls. The secretome of the fungus grown on sugarcane bagasse showed an enhancement of xylanase enzymes while, in the secretome of the fungus grown on cassava bagasse, higher levels of cellulases, amylases and pectinases were observed. On the other hand, the optimized enzyme cocktails from A. niger LBM 134 were applied on the hydrolysis of sugarcane and cassava bagasses obtaining higher levels of fermentable sugars than the obtained with commercial enzymes. These results conclude that xylanase and cellulase activities were good enough to enzymatically hydrolyze the sugarcane and cassava bagasses.