Optimización de las condiciones de secreción de celulasas de hongos nativos de la provincia de Misiones, Argentina para su aplicación en la sacarificación enzimática

Abstract

El reemplazo a gran escala de combustibles derivados del petróleo por biocombustibles, tales como el bioetanol obtenido a partir de material lignocelulósico, se presenta como un enfoque poderoso para satisfacer las crecientes demandas energéticas. Los hongos de pudrición blanca pueden degradar la mayoría de los componentes de la madera debido a su capacidad de sintetizar enzimas hidrolíticas extracelulares. El costo de las enzimas es uno de los factores que determina la economía de un proceso biocatalítico y puede reducirse encontrando las condiciones óptimas para su producción. Por lo tanto, la búsqueda de nuevos aislamientos de microorganismos capaces de producir celulasas y el incremento de la actividad hidrolítica de extractos de cultivos de estos hongos mediante procesos mejorados, es una manera de reducir los costos de las enzimas utilizadas en la hidrólisis de los azúcares poliméricos a azúcares fermentables. El objetivo del trabajo fue seleccionar hongos de pudrición blanca autóctonos de la provincia de Misiones con capacidad celulolítica y optimizar los parámetros de cultivo en fermentación de tipo sumergido para la máxima secreción de celulasas (endo-1,4-β-glucanasas, exo-1,4-β-glucanasas y β-glucosidasas) secretadas por los hongos seleccionados, para su utilización en la etapa de sacarificación para la producción de bioetanol. En la etapa inicial se examinó el potencial celulolítico de 24 hongos de pudrición blanca autóctonos de la provincia de Misiones. Estos ensayos se realizaron en medio líquido, cuantificándose las enzimas endo-1,4-β-glucanasas, exo-1,4-β-glucanasas, β-glucosidasas y la acción conjunta de las tres enzimas. Del análisis de estos ensayos, se seleccionan dos aislamientos que mostraron mayor actividad celulolítica: Irpex lacteus BAFC 1171 y Pycnoporus sanguineus BAFC 2126. Para aumentar la secreción de celulasas de los aislamientos seleccionados, se optimizó tanto el medio (medio mineral, fuente de nitrógeno y carbono) como las demás variables de cultivo (pH, temperatura de cultivo y agitación). Mediante un diseño experimental, se procedió a la optimización de los componentes del medio mineral con influencia significativa sobre la secreción celulolítica (CaCl2.2 (H2O), MgSO4.7 (H2O) y KH2PO4). En P. sanguineus se continuó además con la optimización del KH2PO4 debido a su influencia positiva sobre el sistema y a que el nivel óptimo era el máximo ensayado en el diseño experimental inicial. Se utilizó el método de superficie de respuesta para la optimización de las concentraciones de las fuentes de nitrógeno (sulfato de amonio, extracto de levadura y urea) y carbono (harina de madera de pino y eucalipto) para cada aislamiento. Del mismo modo se ajustaron el pH inicial, la temperatura de cultivo y la agitación. Con estos parámetros de cultivo optimizados, se estudió la evolución de la fuente de carbono y nitrógeno durante el cultivo, así como el pH, biomasa, secreción celulolítica y proteica. La máxima secreción celulolítica se obtuvo cuando los aislamientos se encontraron en estado de crecimiento estacionario. Las condiciones del medio optimizado se utilizaron para la producción celulolítica en un bio-reactor de 2 L, obteniéndose una elevada actividad de EGs para I. lacteus entre las 216 y las 240 h (6.900 U/L) y de BGLs para P. sanguineus, con 377 U/L a las 192 h de cultivo. Los extractos obtenidos se utilizaron para sacarificar material lignocelulósico de eucalipto y pino pretratado con 2 % NaOH a 121ºC durante 30 min. La sacarificación se realizó a 50ºC y 200 rpm y los mayores porcentajes de recuperación de azúcares se obtuvieron a las 72 h de sacarificación. Estos resultados avalan el potencial biotecnológico de los hongos seleccionados y realzan las posibilidades de bioprospección de aislamientos nativos de la micoflora de ambientes naturales de nuestro país.

The large-scale replacement of petroleum-based fuels by biofuels, such as bioethanol from lignocellulosic material, is presented as a powerful approach to meet the growing energy demands. White rot fungi degrade most of the components of wood due to their capacity to synthesize extracellular hydrolytic enzymes. The enzyme cost is one critical factor that determines the economy of a biocatalytic process and can be reduced by finding the optimum conditions for its production. Therefore, finding new isolates of microorganisms capable of producing cellulases and increased the hydrolytic activity of culture extracts of these fungi by improved processes, it is a way to reduce the costs of the enzymes used in hydrolysis of polymeric sugars to fermentable sugars. The aim of the work was to select native white rot fungi of the province of Misiones with cellulolytic capacity and optimize parameters of cultivation in submerged fermentation for maximum secretion of cellulases (endo-1,4-β-glucanases, exo-1,4-β-glucanases and β-glucosidases) secreted by the selected fungi for use in the saccharification step for producing bioethanol. As a first step the potential cellulolytic of 24 native white rot fungi of the province of Misiones was examined. These tests were conducted in liquid medium and endo-1,4-β-glucanases, exo-1,4-β-glucanases, β-glucosidases and the jointly action of the three enzymes were quantified. From the analysis of these trials, two isolates that showed higher cellulolytic activity were selected: Irpex lacteus BAFC 1171 and Pycnoporus sanguineus BAFC 2126. To enhance cellulases secretion of the selected isolates, medium (mineral medium, carbon and nitrogen source) and the other culture variables (pH, temperature and agitation culture) were optimized. Using an experimental design, mineral medium components with significant influence over the cellulolytic secretion (CaCl2.2 (H2O), MgSO4.7 (H2O) and KH2PO4) were optimized. For P. sanguineus, the optimization trials continued by changing KH2PO4 concentration due to its positive influence on cellulolytic production. The response surface method was used to optimize the concentrations of the nitrogen (ammonium sulfate, yeast extract and urea) and carbon source (pine and eucalyptus wood flour) for each strain. In the same way pH, culture temperature and agitation were adjusted. With these culture parameters optimized, the evolution of nitrogen and carbon source during culture were studied, as well as the pH, biomass, cellulolytic and protein secretion. The maximum cellulolytic secretion was obtained at the point of steady state growth of the strains. Optimized medium conditions for the cellulolytic production in a bio-reactor of 2 L were conducted. High activity of EGs by I. lacteus between 216 and 240 h (6,900 U/L) and BGLs by P. sanguineus, 377 U/L at 192 h of cultivation were achieved. Extracts obtained were used for the saccharification of lignocellulosic materials, consisted of eucalyptus and pine pretreated with 2% NaOH at 121°C for 30 min. The saccharification was performed at 50°C and 200 rpm and the highest sugar recoveries were obtained at 72 h of saccharification. Results support the biotechnological potential of selected fungi and enhance the opportunity for bioprospecting of native strains from natural environments mycoflora of our country.