Aplicación de lipasas de Penicillium sp. en la biodegradación de aguas residuales ricas en lípidos

Abstract

El desarrollo industrial y el desmesurado crecimiento demográfico han aumentado la necesidad dedesarrollar una gestión integrada de los recursos hídricos, como requisito para la preservacióndel medio ambiente y el desarrollo económico. Grandes cantidades de aguas residuales (industriales, agrícolas y domésticas) son vertidas a las cuencas sin un tratamiento previo generando un exceso de contaminantes en las mismas. Es conocido que un exceso en lípidos causa serios problemas ambientales como la obstrucción de la línea de alcantarillado y la generación de una capa aceitosa en la superficie del agua que evita que la penetración del oxígeno y la luz solar afectando la vida acuática. Los métodos de tratamiento físico-químico existentes para las aguas residuales ricas en lípidos son costosos, no son ecológicos y plantean un problema secundario de contaminación. La biorremediación mediada por lipasa (E.C. 3.1.1.3) microbiana presenta un enfoque alternativo atractivo para superar estos problemas. Teniendo en cuenta este contexto esta tesis doctoral se centró en la caracterización de lipasas producidas por aislamientos del género Penicillium y en la evaluación de su potencial aplicación en el proceso de biodegradación de aguas residuales ricas en lípidos. Para ello en primera instancia, se realizó un screening semicuantitativo utilizando métodos fluorométricos el cual permitió la selección de siete aislamientos del género Penicillium con capacidad lipolítica de manera rápida y eficiente. Estos fueron identificados a nivel de especie empleando herramientas moleculares. Posteriormente se evaluó la actividad lipasa en presencia de aceite de oliva eligiéndose a Penicillium rubens LBM 081 por presentar los mayores niveles de actividad lipasa. La actividad lipasa de P. rubens LBM 081, al igual que otras lipasas fúngicas, dependió en gran medida de las fuentes de carbono y de nitrógeno presentes en el medio. La máxima actividad enzimática (2780 U/mL) se logró cuando el hongo creció en el medio de cultivo optimizado suplementado con peptona 2%, aceite de oliva 4% y se inoculó con una concentración de esporas 1x106 e incubó a 30 ºC 140 rpm. P. rubens LBM 081 presentó una enzima de 42 kDa en el medio optimizado. La actividad óptima de la lipasa estuvo dentro del rango encontrado para la mayoría de las lipasas fúngicas 30ºC, su termoestabilidad fue mayor a 30 °C disminuyendo a temperaturas más elevadas probablemente por desnaturalización de la estructura enzimática. El pH óptimo de la lipasa de P. rubens LBM 081 también estuvo dentro del rango encontrado para las lipasas fúngicas de 7. El secretoma del medio optimizado de P. rubens LBM 081 presentó una expresión diferencial de las enzimas implicadas en degradar los compuestos lipídicos presentes en el medio y demostró un incrementó en la cantidad de enzimas lipoliticas secretadas. El sobrenadante enzimático optimizado con altos títulos de actividad lipasa de P. rubens LBM 081 disminuyó la concentración de DQO, de aceites y grasas totales y toxicidad demostrando un potencial en la remediación de los efluentes utilizados.

Industrial development and disproportionate population growth have increased the need to develop an integrated management of water resources, as a requirement for the preservation of the environment and economic development. Large amounts of wastewater (industrial, agricultural and domestic) are discharged into the basins without prior treatment, generating an excess of pollutants in them. It is known that an excess in lipids causes serious environmental problems such as the obstruction of the sewage line and the generation of an oily layer on the surface of the water that prevents the penetration of oxygen and sunlight, affecting aquatic life. Existing physical-chemical treatment methods for lipid-rich wastewater are costly, not environmentally friendly, and pose a secondary pollution problem. Microbial lipase (EC 3.1.1.3) mediated bioremediation presents an attractive alternative approach to overcome these problems. Considering this context, this doctoral thesis was focused on the characterization of lipases produced by isolates of the genus Penicillium and on the evaluation of their potential application in the biodegradation process of lipid-rich wastewater. For this, in the first instance, a semi-quantitative screening was made using fluorometric methods which allowed a quick and efficent selection of seven isolates of the genus Penicillium with lipolytic capacity. These were identified to the species level using molecular tools. Subsequently, lipase activity was evaluated in the presence of olive oil, choosing Penicillium rubens LBM 081 for presenting the highest levels of lipase activity. Like other fungal lipases, the lipase activity of P. rubens LBM 081 depended largely on the carbon and nitrogen sources present in the medium. The maximum enzymatic activity (2780 U/mL) was achieved when the fungus grew in the optimized culture medium supplemented with 2% peptone, 4% olive oil, inoculated with a concentration of 1x106 spores, and incubated at 30 º C 140 rpm. P. rubens LBM 081 presented an enzyme lipase of 42 kDa in the optimized medium. The optimal activity of the lipase was within the range found for most fungal lipases at 30ºC, its thermostability was greater at 30ºC, decreasing at higher temperatures, probably due to denaturation of the enzymatic structure. The optimal pH of the lipase from P. rubens LBM 081 was also within the range found for fungal lipases of 7. The secretome of P. rubens LBM 081 on the optimized medium presented a differential expression of the enzymes involved in degrading the lipid compounds present in the medium and showed an increase in the amount of lipolytic enzymes secreted. The optimized enzymatic supernatant with high titles of lipase activity from P. rubens LBM 081 decreased the concentration of COD, total oils and fats, and toxicity showing a potential in the remediation of the effluents used.