Análisis genómico comparativo, filogenético y descriptivo de la vía biosintética de la cafeína en Ilex paraguariensis A. ST. HIL.

Abstract

Ilex paraguariensis St. Hil. (familia Aquifoliaceae) es un árbol dioico que es originario de las selvas subtropicales de América del Sur. Tanto sus hojas como sus pequeñas ramas secas son procesadas y utilizadas para preparar la infusión popular, estimulante y de sabor particular, conocida como “mate”, de allí que su nombre coloquial en América Latina sea “yerba mate”. Los estudios sobre las propiedades medicinales de la yerba mate se han incrementado en la última década y existe un consenso actual sobre sus efectos benéficos como antioxidante, antiinflamatorio, antimutagénico y sobre el metabolismo lipídico y de la cafeína que renuevan el interés en el estudio de esta importante especie. El objetivo general del trabajo se basó en el análisis desde el punto de vista genómico y filogenético de la vía biosintética de la cafeína comparativamente con la existente en otros organismos de importancia agronómica como Coffea, Theobroma, Camellia, entre otras, prediciendo el impacto de las variaciones encontradas a nivel proteómico y metabolómico. Con el propósito de elucidar el repertorio de expresión de los genes relacionados a la vía biosintética de la cafeína de yerba mate, se exploró y descubrió una vasta colección de transcriptos de I. paraguariensis utilizando como genoma de referencia a la línea Pg538, material elite desarrollado por el INTA EAA-Cerro Azul de Misiones y utilizando los datos aportados por el transcriptoma de I. paraguariensis secuenciado por Debat et. al en 2014. De este análisis, a partir las 72.031.388 secuencias de 100 pb obtenidas y las lecturas de alta calidad, fueron ensambladas de novo en 44.907 transcriptos, abarcando 40 millones de bases con una cobertura estimada de 180X. Múltiples análisis de secuencias permitieron inferir que la yerba mate contiene alrededor de 32.355 genes y 12.551 variantes. Asimismo, mediante la herramienta del transcriptoma, se identificaron y categorizaron transcriptos pertenecientes a más de 100 vías metabólicas, y gracias a esta primera descripción, se procedió a realizar el análisis genómico comparativo y filogenético de la vía metabólica de los transcriptos involucrados en producción de la cafeína. Se realizó un examen filogenético de las enzimas de una gran familia de genes denominados SABATH (Salicylic Acid, Benzoic Acid, Theobromine methyltransferase) que catalizan la metilación de átomos de oxígeno de una amplia diversidad de ácidos carboxílicos como, por ejemplo, ácido antranílico, benzoico, giberílico, jasmónico, logánico, salicílico y ácido indol-3 acético. Los genes evolucionados más recientemente de la familia SABATH son los que corresponden a la vía XMT (Metiltransferasas de Xantina) y CS (Cafeína Sintasa). Se obtuvieron 19 enzimas SABATH del transcriptoma y, a partir de los datos generados del genoma se analizaron 26 genes completos y 3 pseudogenes, para determinar qué tipo de metiltransferasas utiliza la yerba mate en el proceso metabólico de la conversión de cafeína. La vía de biosíntesis de la cafeína es una vía común a una serie de especies de gran importancia económica por la generación de teobromina y cafeína como bioproductos de gran impacto económico y cultural. Se pudieron identificar, categorizar y caracterizar tres genes que codifican para las enzimas que catalizan los 3 pasos de reacción de la vía de biosíntesis desde la xantina a la conversión de cafeína en yerba (IpCS1, IpCS2 e IpCS3). Mediante ensayos enzimáticos de los productos purificados, pudieron detectarse los sustratos específicos midiendo actividad catalítica de cada enzima. Se los nombraron como IpCS1, IpCS2 e IpCS3 ya que siguen la vía de conversión mediada por cafeína sintasa (CS). Se concluyó que la enzima (IpCS1) muestra preferencia para catalizar la formación de 3- metilxantina a partir de xantina como sustrato. La segunda enzima descrita en este estudio (IpCS2) presenta actividad con 3-metilxantina para producir teobromina, pero no presenta actividad alguna con otros sustratos. La tercera enzima, (IpCS3) metila al máximo teobromina para formar cafeína. Colectivamente estas tres enzimas son capaces de catalizar una vía completa de biosíntesis desde xantina a cafeína en yerba mate. Dicha vía desde X>>3X>>TB>>CF ha sido también descrita para Theobroma y Paullinia y éstas plantas también usan enzimas SABATH de tipo CS para catalizar las reacciones de producción de cafeína. El conocimiento de la genómica comparativa de las enzimas involucradas en esta vía permitió cuantificar el peso de las variaciones genéticas de la yerba mate en comparación con otras especies productoras de cafeína de gran interés agronómico mediante un estudio de microsintenia y al mismo momento se compararon órdenes de plantas no productoras de cafeína, pudiendo denotarse la falta de éstos genes ortólogos de una vía que ha sido muy conservada en la evolución de varias especies de eudicotas.

Ilex paraguariensis St. Hil. (Aquifoliaceae family) is a dioecious tree native from the subtropical forests of South America. Its leaves and small twigs processed are used to prepare the popular, stimulating and particular flavor infusion, known as "mate", hence its colloquial name in Latin America be "yerba mate". Studies on the medicinal properties of yerba mate have increased in the last decade and there is a current consensus on its beneficial effects as an antioxidant, anti-inflammatory, anti-mutagenic and on lipid and caffeine metabolism that renews the interest of the study of this important specie. The general objective of the work was based on the analysis from the genomic and phylogenetic point of view of the caffeine biosynthetic pathway in comparison with other organisms of agronomic importance, such as Coffea, Theobroma, Camellia among others, predicting the impact of changes encountered at proteomic and metabolomics level. With the aim of elucidating the repertoire of yerba mate gene expression related to the caffeine biosynthetic pathway, it was explored and discovered a vast collection of transcripts of I. paraguariensis using as a reference genome the Pg538 line, elite material developed by INTA EAA-Cerro Azul Misiones. This could be carried out through the data provided by the transcriptome of I. paraguariensis sequenced by Debat et. al in 2014, obtaining 72,031,388 sequences of 100 bp. The high quality readings obtained were assembled de novo in 44,907 transcripts, covering 40 million bases with an estimated 180X coverage. Multiple sequence analysis allowed us to infer that the yerba mate contains ~ 32,355 genes and 12,551 gene variants. Also, they were identified and categorized transcripts from more than 100 metabolic pathways and thanks to this first description, we proceeded to perform the comparative and phylogenetic genomic analysis of the metabolic pathway of the transcripts involved in the caffeine production. A phylogenetic examination of the enzymes of a large family of genes named SABATH (Salicylic Acid, Benzoic Acid, Theobromine methyltransferase) that catalyze the methylation of oxygen atoms of a wide variety of carboxylic acids such as, for example, anthranilic, benzoic, giberilic acid, jasmonic, loganic, salicylic and indole-3-Acetic Acid, was performed. The most recent evolved SABATH genes correspond to the XMT (Xanthosine Methyltransferase) and CS (Caffeine Sintase) enzymes pathway. 19 transcriptome SABATH enzymes were obtained, and 26 complete genes and 3 pseudogenes were analyzed from the genome generated data, to determine what type of methyltransferases are used in the metabolic process of caffeine carried out by yerba mate. The caffeine biosynthetic pathway is a common pathway to a number of species of great economic importance for the generation of theobromine and caffeine as bioproducts of great economic and cultural impact. The three genes encoding the enzymes that catalyze the 3 reaction steps of the biosynthesis pathway from xanthine to caffeine conversion could be identified (IpCS1, IpCS2 and IpCS3). By enzymatic assays of the purified products, specific substrates could be detected by measuring catalytic activity of each enzyme. They were named as IpCS1, IpCS2 and IpCS3 as they follow the caffeine synthase (CS) mediated conversion pathway. It concluded, one enzyme (IpCS1) appears to prefer to catalyze the formation of 3- methylxanthine when provided xanthine. A second enzyme (IpCS2), shows activity with 3- methylxanthine to produce theobromine but no activity with any other substrate. A third enzyme (IpCS3) maximally methylates theobromine to form caffeine. collectively these three enzymes appear capable of catalyzing a complete pathway from xanthine to caffeine in yerba mate. A pathway from X to 3X to TB to CF has also been reported for Theobroma and Paullinia and these plants also use CS-type SABATH enzymes to catalyze the caffeine pathway. Knowledge of the comparative genomics of the enzymes involved in this pathway made it possible to quantify the weight of the genetic variations of yerba mate compared to others caffeine-producing species of great agronomic interest through a microsynteny study, and at the same time, it compared orders of non-caffeine-producing plants, and the lack of these orthologous genes could be denoted in a pathway that has been highly conserved in the evolution of various species of eudicots.