Caracterización de cepas fúngicas de escovopsis nativas de misiones antagonistas de leucoagaricus para control biológico de hormigas cortadoras de hojas

Abstract

En la provincia de Misiones, una de las principales plagas que afecta el sector forestal primario, son las hormigas cortadoras de hojas. Su actividad forrajera consiste en cortar y transportar hasta su nido material vegetal fresco, sobre el cual crece el hongo Leucoagaricus gongylophorus, que es su principal fuente de alimento. Por su parte, los hongos del género Escovopsis, se consideran parásitos especialistas de L. gongylophorus. Por tanto, Escovopsis, se representa como un potencial biocontrolador, comprometiendo de manera indirecta la salud y supervivencia de las colonias de hormigas. Entonces, un mejor entendimiento de su biología y mecanismos de acción son determinantes para su aplicación biotecnológica. El objetivo general del presente trabajo fue, aislar, identificar y caracterizar cepas fúngicas del género Escovopsis nativas de Misiones con capacidad biocontroladora del hongo simbionte Leucoagaricus. En primera instancia, se aislaron 11 cepas del género Escovopsis a partir de nidos de hormigas cortadoras de hojas del género Acromyrmex, en ecosistemas naturales de la provincia de Misiones. Los aislamientos obtenidos fueron identificados y caracterizados mediante un estudio polifásico: la cepa HMP1 (LBM269) se identificó como E. microspora, las cepas HMP2 (LBM270), HMP3 (LBM271), HMP4 (LBM272), HMP7 (LBM275), HMP9 (LBM277), HMP10 (LBM278) y HMP11 (LBM279) como E. primorosea, las cepas HMP5 (LBM273) y HMP6 (LBM274) como E. weberi; y la cepa HMP8 (LBM276) se identificó como E. catenulata. Para evaluar su capacidad antagónica frente a L. gongylophorus (LBM265), las pruebas de patogenicidad mostraron que todos los aislamientos de Escovopsis alcanzaron el máximo de virulencia (grado 4) frente a L. gongylophorus. Particularmente, E. primorosea HMP9 además de presentar una capacidad antagónica satisfactoria, obtuvo el mayor grado de inhibición (mayor al 90%) y redujo de manera significativa el crecimiento de L. gongylophorus. Por tanto, este aislamiento fue seleccionado como promisorio. En los ensayos de microcultivos fue caracterizado como un micoparásito necrotrófico de contacto. Posteriormente se seleccionaron y optimizaron los parámetros de fermentación líquida más relevantes que promovieron una mayor secreción de enzimas micolíticas en este micoparásito promisorio. Mediante diseños experimentales factoriales y de RSM Box-Behnken, fue posible optimizar la actividad enzimática, empleando como fuente de carbono paredes celulares de L. gongylophorus (0,36 g/L), y como fuente de nitrógeno el complejo Mandels cuya concentración de componentes nitrogenados fueron, urea (0,1 g/L), extracto de levadura (1,86 g/L) y sulfato de amonio (0,21 g/L). El pH inicial del medio de cultivo fue de 4,63 y la concentración de inoculo 4 x 106 esporas/mL. Con respecto a la actividad proteasa la actividad enzimática se incrementó en un 71,4% (3,5 veces); la actividad β-1,3-glucanasa se optimizó un 85,1% (6,7 veces); y la actividad quitinasa se optimizó un 85,2% (6,8 veces) en comparación al medio de cultivo sin optimizar. Una vez obtenidos los sobrenadantes optimizados, se caracterizaron bioquímicamente. Con respecto a las condiciones de reacción óptimas, la actividad proteasa, presentó la máxima actividad a 85°C y pH 7,4. Para la actividad quitinasa no se observaron diferencias significativas en el rango de temperatura de 37 a 55°C, y entre los pHs 4 a 5, obteniéndose una mayor actividad a 45°C y pH 4. Para β-1,3-glucanasas se obtuvo la máxima actividad a 60°C y pH 5. Con respecto a la estabilidad en el tiempo, a temperatura ambiente la actividad residual proteasa fue mayor al 70% durante 25 días de incubación; para β-1,3-glucanasas fue mayor al 90% durante los 30 días y para quitinasas, superó 70% durante 15 días. En heladera, la actividad residual de proteasas y β-1,3-glucanasas se mantuvo por encima de 90 y 80% respectivamente, durante los 30 días. Para quitinasas, superó el 70% durante 25 días. Para temperaturas de reacción óptimas, la actividad residual de las tres enzimas disminuyó por debajo de 25% a los 5 minutos de incubación, con una vida media de 25 min. Con respecto a la estabilidad del pH en el tiempo, la actividad residual proteasa, se mantuvo por encima de 50% durante 30 días. Se observó una mayor estabilidad a pH 6 sin diferencias significativas; y los pHs 7,4 y 8 presentaron diferencias significativas al día 10 de incubación. Para β-1,3-glucanasas, la actividad residual se mantuvo mayor al 70% durante los 30 días de incubación para los pH 4, 5 y 6. La actividad quitinasa mostró diferencias significativas al día 10 de incubación, para pH 3, con una actividad residual menor al 50%. Para pH 4 y 5, se mantuvo por encima de 70% durante 20 días de incubación. Finalmente se determinó el perfil isoenzimático para las tres enzimas micolíticas, detectándose que: E. primorosea HMP9, produce un sistema micolítico que consiste en al menos una enzima proteasa, una β-1,3-glucanasa y dos quitinasas en condiciones inductivas con paredes celulares fúngicas de L. gongylophorus como fuente de carbono y el complejo nitrogenado Mandels como fuente de nitrógeno. Los resultados obtenidos, representan un gran aporte al estudio de este micoparásito fúngico y sientan bases microbiológicas de gran importancia para la generación de un formulado enzimático micolítico y su posterior aplicación biotecnológica en el control biológico indirecto de hormigas cortadoras de hojas.

In the province of Misiones, leaf-cutter ants are one of the main plagues that affects the primary forest sector. These ants engage in foraging activities Its fodder activity by cutting and transporting to its nest fresh plant material, on which the fungus Leucoagagaricus gongylophorus grows, which is its main source of food. On the other hand, the fungi of the Escovopsis genus, are considered specialist parasites of L. Gongylophorus. Therefore, Escovopsis, is represented as a potential biocontrol agent, indirectly compromising the health and survival of ants colonies. Then, a better understanding of their biology and mechanisms of action of Escovopsis crucial for its biotechnological application. The general objective of the present work was, to identify and characterize fungal strains Escovopsis genus native of Misiones with biocontrol capacity of the symbiont fungus Leucoagaricus. In the first instance, 11 strains of the genus Escovopsis were isolated from nests of leaf-cutters ants of the genus Acromyrmex, in natural ecosystems of the province of Misiones. The isolates underwent a polyphasic study for identification and characterization. The HMP1 (LBM269) strain was identified as E. microspora, the strains HMP2 (LBM270), HMP3 (LBM271), HMP4 (LBM272), HMP7 (LBM275), HMP9 (LBM277), HMP10 (LBM278) and HMP11 (LBM279) were identified as E. Primorosea, HMP5 (LBM273) and HMP6 (LBM274) strains were identified as E. Weberi; and the HMP8 strain (LBM276) was identified as E. catenulata. In the evaluation of their antagonistic capacity against L. gongylophorus all isolates showed the highest virulence (Grade 4). Related to the latter, the isolate E. primorosea HMP9, in addition to presenting a good antagonistic capacity, obtained the highest degree of inhibition (greater than 90%) and reduced significantly the growth of L. Gongylophorus. Therefore, this isolate was selected as promising for further studies. In microculture tests it was characterized as a contact necrotrophic mycoparasite. Subsequently, the most relevant liquid fermentation parameters were selected and optimized to promoted a greater secretion of mycolitic enzymes in this promising mycoparasite. Through factorial and RSM Box-Behnken experimental designs, it was possible to optimize the enzymatic activity, using Cell walls of L. Gongylophorus (0.36 g/L) as a carbon source; and as a nitrogen source the Mandels complex whose concentration of nitrogen components were urea (0.1 g/L), yeast extract (1.86 g/L) and ammonium sulfate (0.21 g/L). The initial pH of the culture media was 4.63 and the inoculum concentration 4 x 106 spores/mL. Related to protease activity, enzymatic activity increased 71.4% (3.5 times); The activity β-1,3-glucanase was optimized 85.1% (6.7 times); and the chitinase activity was optimized 85.2% (6.8 times) compared to the culture media without optimizing. Once the optimized supernatants were obtained, they were biochemically characterized. Related to the optimal reaction conditions, the protease activity, presented the maximum activity at 85 °C and pH 7.4. For the chitinase activity, no significant differences were observed in the temperature range of 37 to 55 °C, and between pHs 4 to 5, obtaining greater activity at 45 °C and pH 4. For β-1,3-glycanases obtained maximum activity at 60 °C and pH 5. Regarding time stability, at room temperature, protease residual activity was greater than 70% for 25 days of incubation; for β-1,3-glucanases it was greater than 90% during the 30 days and for chitinases, it exceeded 70% for 15 days. In refrigerator, the residual activity of proteases and β-1,3-glucanases remained above 90 and 80% respectively, during the 30 days. For chitinase, it exceeded 70% for 25 days. For optimal reaction temperatures, the residual activity of the three enzymes decreased below 25% to 5 min of incubation, with a half-life of 25 min. With respect to the stability of pH over time, protease residual activity remained above 50% for 30 days. Greater stability was observed at pH 6 without significant differences; and pHs 7.4 and 8 presented significant differences on the 10th day of incubation. For β-1,3-glucanases, the residual activity remained greater than 70% during the 30 days of incubation for pH 4,5 and 6. The chitinase activity showed significant differences on the 10th day of incubation, for pH 3, with a residual activity less than 50%. For pH 4 and 5, it remained above 70% for 20 days of incubation. Finally, the isoenzimatic profile for the three mycolitic enzymes was determined, revealing that E. primorosea HMP9, produces a mycolitic system consisting of at least one protease enzyme, one β-1,3-glucanase and two chitinases in conditions of induction with fungal cell walls of L. Gongylophorus as a carbon source and the Mandels nitrogen complex as a nitrogen source. To the best of our knowledge, these results makes a significant contribution to the study of this fungal mycoparasite and establish important microbiological foundation for the development of a mycolitic enzymatic formulation and its subsequent biotechnological application in the indirect biological control of leaf cutters ants.