Desarrollo de un formulado enzimático a base de trichoderma koningiopsis con capacidad biocontroladora de hongos fitopatógenos

Abstract

Los fitopatógenos causan enfermedades que resultan en una pérdida significativa de calidad y rendimiento de valiosos cultivos en todo el mundo. El uso de microorganismos biocontroladores se presenta como un enfoque ecológico alternativo para superar los problemas causados por los pesticidas químicos utilizados en los métodos tradicionales de protección de las plantas. Trichoderma actúa como agente de biocontrol secretando compuestos antifúngicos, como enzimas hidrolíticas, principalmente quitinasas, β-1,3-glucanasas y proteasas, capaces de hidrolizar los componentes de las paredes celulares de su hospedero. Nuestro grupo de trabajo seleccionó al aislamiento Trichoderma koningiopsis POS7 por su elevada capacidad antagónica evaluada in vitro, y secuenció su genoma mediante la tecnología Truseq (Illumina Inc.). En base a diversos enfoques multidisciplinares como ser la Micología, Bioinformática, Química, Bioquímica y la Ingeniería de bioprocesos se propuso optimizar la secreción de enzimas hidrolíticas del aislamiento fúngico T. koningiopsis POS7, involucradas en el proceso de control biológico de hongos fitopatógenos en cultivos agrícolas, para el futuro desarrollo de un formulado enzimático, a partir de la predicción in silico de genes y motivos reguladores implicados en el control de la activación de la síntesis de esas enzimas. En primer lugar, utilizando el software bioinformático Geneiuos 9.1.5 se lograron localizar, caracterizar y anotar en el genoma secuenciado de T. koningiopsis POS7, las regiones estructurales (en intrones y exones) de 18 genes, de los cuales 7 codifican para enzimas quitinasas, 10 para enzimas β-1,3-glucanasas y 1 para la enzima proteasa. Dichos genes se reportaron en la base de datos del NCBI. Del análisis realizado de la región promotora de cada uno de estos genes, se pudieron identificar las secuencias reguladoras más frecuentes para eucariotas, como ser: cajas TATA, cajas CAAT, cajas CAAT invertidas (ATTG). En los 18 genes se identificaron y anotaron además, secuencias reguladoras implicadas en la represión catabólica del carbono; en la represión catabólica de nitrógeno; en la inducción del estrés fisiológico; y sitios de unión para la proteína reguladora de pH; mientras que sólo en algunos genes se anotaron y localizaron sitios de unión putativos para proteínas con funciones reguladoras durante el micoparasitismo, sitios de unión para el factor de la conidiación y elementos de respuestas a la esporulación inducida por la luz. La información recopilada de dicho análisis se utilizó para la posterior selección de factores y optimización enzimática en fermentación líquida en condiciones controladas. Para ello, se evaluaron diversos componentes del medio de cultivo teniendo como referencia los inductores enzimáticos predichos bioinformáticamente. Se consiguió seleccionar la fuente de carbono (paredes celulares de Fusarium sp. tratadas) y la fuente de nitrógeno (Extracto de levadura), que mostraron diferencias estadísticamente significativas con respecto a los otros componentes ensayados, en relación a la inducción de la secreción de las enzimas hidrolíticas. A través de diversos diseños experimentales se procedió a optimizar las concentraciones de dichos componentes, y de las variables físico-químicas, como la concentración del inóculo y el pH inicial del medio, las cuales también contribuyeron significativamente en la optimización de la secreción enzimática. Una vez concluida la etapa de optimización se logró un aumento en la secreción enzimática de 258 %, 251 % y 247 % de quitinasas, β-1,3-glucanasas y proteasas respectivamente, en relación a sus actividades en condiciones iniciales. El formulado enzimático optimizado se caracterizó bioquímicamente obteniéndose las temperaturas y pH de reacción óptimos para cada enzima de interés. Además, se evaluó la termoestabilidad en el tiempo en tres temperaturas: temperatura de reacción óptima para cada enzima; temperatura de aplicación (ambiente 24 °C); y temperatura de almacenamiento (heladera 5 °C). Donde se obtuvo una estabilidad enzimática mayor al 50 % en el transcurso de 96 horas de incubación para las tres enzimas, tanto a temperatura de aplicación como a temperatura de almacenamiento. También en los ensayos de estabilidad de pH para cada una de las enzimas en estudio, a temperatura ambiente, se observó una estabilidad enzimática mayor al 50 % en el transcurso de 96 horas en el rango de pH entre 4,8 y 8, para las tres enzimas. Por último, se evaluó el efecto del formulado enzimático optimizado en pruebas in vitro e in vivo. En los ensayos en placas de Petri, se consiguió una reducción del 40 % a 42 % del tamaño de la colonia de Alternaria sp., con efecto biocontrolador duradero, cuando fue aplicado el formulado enzimático optimizado, en relación a los ensayos controles. En los ensayos sobre la germinación de semillas de tomates infectadas con Alternaria sp., se observó un control positivo y estadísticamente significativo en el crecimiento del aislamiento fitopatógeno. Además de la capacidad de biocontrol, el formulado enzimático optimizado presentó una notable capacidad de bioestimulación sobre las semillas de tomate, ya que se observó una tasa de germinación de semillas del 81,65 %, con diferencias estadísticamente significativas en relación a los demás tratamientos y controles. A partir del presente trabajo se logró obtener un formulado enzimático optimizado a base de esporas y enzimas de T. koningiopsis POS7 con capacidad biocontroladora y bioestimulante. Lo cual se presenta como una herramienta biotecnológica, sustentable, orgánica e innovadora para la generación de bioinsumos de nueva generación.

Phytopathogens cause diseases that result in significant loss of quality and yield of valuable crops worldwide. The use of biocontrol microorganisms is presented as an alternative ecological approach to overcome the problems caused by chemical pesticides used in traditional plant protection methods. Trichoderma acts as a biocontrol agent by secreting antifungal compounds, such as hydrolytic enzymes, mainly chitinases, β-1,3-glucanases, and proteases, capable of hydrolyzing the components of the cell walls of its host. Our research group selected the Trichoderma koningiopsis POS7 isolate for its high antagonistic capacity evaluated in vitro, and sequenced its genome using Truseq technology (Illumina Inc.). Through various multidisciplinary approaches such as Mycology, Bioinformatics, Chemistry, Biochemistry, and Bioprocess Engineering, we proposed to optimize the secretion of hydrolytic enzymes from the fungal isolate T. koningiopsis POS7, involved in the biological control of phytopathogenic fungi in agricultural crops, for the future development of an enzymatic formulation based on the in silico prediction of genes and regulatory motifs involved in controlling the activation of enzyme synthesis. First, using the bioinformatics software Geneious 9.1.5, we were able to locate, characterize, and annotate in the sequenced genome of T. koningiopsis POS7 the structural regions (introns and exons) of 18 genes, of which 7 encode chitinase enzymes, 10 encode β- 1,3-glucanase enzymes, and 1 encodes the protease enzyme. These genes were reported in the NCBI database. Through the analysis of the promoter region for each of these genes, the most frequent regulatory sequences for eukaryotes were identified, including TATA boxes, CAAT boxes, and inverted CAAT boxes (ATTG). Additionally, in the 18 genes, we identified and annotated regulatory sequences involved with carbon catabolite repression, nitrogen repression, induction of physiological stress, and binding sites for pH regulatory protein. Some genes were also annotated and localized with putative binding sites for proteins with regulatory functions during mycoparasitism, binding sites for conidiation factors, and light-induced sporulation response elements. The information collected from this analysis was used for the subsequent selection of factors and enzymatic optimization in liquid fermentation under controlled conditions. To accomplish this, we evaluated various components of the culture medium, taking into account the enzymatic inducers predicted by bioinformatics. The carbon source (treated Fusarium sp. cell walls) and the nitrogen source (yeast extract) were successfully chosen, demonstarting statistically significant differences compared to the other tested components in inducing the secretion of hydrolytic enzymes. Through multiple experimental designs, we optimized the concentrations of these components and physicochemical variables such as inoculum concentration and initial pH of the medium, which significantly contributed to the boptimization of enzyme secretion. Following the completion of the optimization stage, we achieved a remarkable increase in enzyme secretion: chitinases, β-1,3-glucanases, and proteases exhibited activity levels 258 %, 251 %, and 247 % higher respectively, compared to their activities under initial conditions. The optimized enzymatic formulation underwent biochemical characterization to determine the optimal reaction temperatures and pH for each enzyme of interest. Additionally, the time-dependent thermo-stability was evaluated at three temperatures: the optimal reaction temperature for each enzyme, application temperature (24 °C), and storage temperature (5 °C in the refrigerator). The enzymatic stability remained above 50 % over a 96-hour incubation period for all three enzymes, both at the application and storage temperatures. The stability tests for pH for each of the enzymes studied at room temperature showed enzymatic stability above 50 % over a 96-hour period in the pH range of 4.8 to 8 for all three enzymes. Subsequently, the impact of the optimized enzymatic formulation was assessed through in vitro and in vivo tests. In Petri dish assays, application of the optimized enzymatic formulation resulted in a reduction of 40 % to 42 % in the colony size of Alternaria sp., with a long-lasting biocontrol effect compared to control assays. In tests on the germination of tomato seeds infected with Alternaria sp., a positive and statistically significant control effect on the growth of the phytopathogenic isolate was observed. In addition to its biocontrol capacity, the optimized enzymatic formulation exhibited a remarkable bio-stimulation capacity on tomato seeds, with a seed germination rate of 81.65 %, showing statistically significant differences compared to the other treatments and controls. This work successfully achieved an optimized enzymatic formulation based on spores and enzymes from T. koningiopsis POS7, showcasing biocontrol and bio-stimulant capabilities. It represents a biotechnological, sustainable, organic, and innovative tool for the generation of next-generation bioinputs.