Biofertilizantes : análisis genómico y trazabilidad de Bacillus sp. aislados de Ilex paraguariensis St. Hil. con propiedades de promoción del crecimiento vegetal

Abstract

El cultivo de Ilex paraguariensis St. Hil. (Aquifoliaceae) es una actividad económica de impacto regional, cuya producción se desarrolla en Sudamérica donde Argentina es el primer productor mundial. Actualmente, las plantaciones de Ilex paraguariensis St. Hil. ocupan aproximadamente 177.534,912 ha distribuidas entre las provincias de Misiones y Corrientes. En los últimos años se ha informado un aumento de cultivos degradados, como resultado del sistema de monocultivo, erosión y compactación del suelo y pérdida de nutrientes, combinada con la poca o nula fertilización. Estos antecedentes orientan la investigación y generación de nuevas tecnologías para la producción sustentable de I. paraguariensis St. Hil. Las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), son un grupo heterogéneo de bacterias capaces de establecer una interacción íntima con las plantas, proporcionando efectos benéficos sobre su crecimiento y desarrollo. El género Bacillus presenta una amplia diversidad de especies, cuya capacidad de formar endoesporas y expresar propiedades para promover el crecimiento de diversos cultivos, las convierte en una alternativa prometedora para su aplicación en prácticas agrícolas sustentables. En estudios previos el grupo de trabajo seleccionó dos cepas de Bacillus sp. aisladas de plantines de I. paraguariensis St. Hil. en la provincia de Misiones, por sus propiedades para estimular el crecimiento vegetal in vitro, en vivero y en plantaciones adultas. A los fines de profundizar los conocimientos sobre sus mecanismos de acción, colonización y persistencia, el presente trabajo de tesis tuvo como objetivo general realizar estudios de trazabilidad que permitan verificar el efecto bioinoculante de Bacillus sp. en plantines de I. paraguariensis St. Hil. bajo condiciones de vivero. Para ello, se extrajo ADN de las cepas Bacillus sp. T5S-T4 y Bacillus sp. 19RS3, y se secuenciaron, ensamblaron y anotaron sus genomas. A partir de las secuencias génicas gyrB y la concatenación de las secuencias 16S-23S-gyrB se identificaron ambas cepas como B. altitudinis T5S-T4 y B. altitudinis 19RS3. Los genomas ensamblados y anotados fueron depositados en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) bajo los números de acceso JACAAI01 y JACAAH01, respectivamente. En función de las anotaciones realizadas se detectaron y caracterizaron los genes responsables de la promoción del crecimiento vegetal a través de mecanismos directos e indirectos. Para verificar el efecto biofertilizante de las cepas, se realizó un ensayo de trazabilidad en vivero, a partir de plantines de I. paraguariensis St. Hil. orgánicos inoculados con B. altitudinis T5S-T4, B. altitudinis 19RS3, la combinación de ambas cepas (B. altitudinis T5S-T4 + B. altitudinis 19RS3) y un control negativo. Cada 15 días se realizaron las mediciones de los parámetros de crecimiento en vivero: altura, número de hojas, diámetro del cuello e índice de clorofila. Una vez finalizado el ensayo, los plantines fueron procesados en el laboratorio y se midieron: pesos frescos y secos de la parte aérea total, de las hojas y de las raíces, y el área foliar. Se realizó el análisis estadístico de todos los parámetros de crecimiento medidos. Se verificó el efecto bioinoculante de la combinación de ambas cepas a partir del incremento significativo de los parámetros de crecimiento: altura, diámetro de cuello, índice de clorofila, y peso fresco de la parte aérea. Para verificar la colonización y persistencia de ambas cepas, se realizó la búsqueda manual de secuencias únicas en ambos genomas para el diseño de cebadores cepa-específicos. Se verificó su especificidad in silico e in vitro y se optimizó la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las cepas B. altitudinis T5S-T4 y B. altitudinis 19RS3 se detectaron en el sustrato, a partir del día 14 y 28 desde su primera inoculación, respectivamente, hasta el día 112 del ensayo. Solo se detectó la cepa B. altitudinis T5S-T4 en raíces inoculadas bajo condiciones de cámara de germinación. En base a los resultados obtenidos, las propiedades ejercidas por B. altitudinis T5S-T4 y B. altitudinis 19RS3 en consorcio, las convierte en excelentes candidatas para la futura generación de un nuevo bioinoculante para I. paraguariensis St. Hil.

The cultivation of Ilex paraguariensis St. Hil. (Aquifoliaceae) is an economic activity of regional impact, whose production is developed in South America, where Argentina is the world's leading producer. Currently, Ilex paraguariensis St. Hil. plantations occupy approximately 177,534.912 ha distributed between the provinces of Misiones and Corrientes. In recent years, an increase in degraded crops has been published, as a result of the monoculture system, soil erosion and compaction, and loss of nutrients, combined with little or no fertilization. These antecedents guide the research and generation of new technologies for the sustainable production of I. paraguariensis St. Hil. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) are a heterogeneous group of bacteria capable of establishing an intimate interaction with plants, providing beneficial effects on their growth, and development. The genus Bacillus has a wide diversity of species, whose ability to form endospores and express properties to promote the growth of various crops, makes them a promising alternative for application in sustainable agricultural practices. In previous studies, the working group selected two strains of Bacillus sp. isolated from seedlings of I. paraguariensis St. Hil. in the province of Misiones, for its properties to stimulate plant growth in vitro, in nursery and adult plantations. To deepen the knowledge about their mechanisms of action, colonization, and persistence, this thesis was to carry out traceability studies to verify the bioinoculant effect of Bacillus sp. on I. paraguariensis St. Hil. seedlings under nursery conditions. For this purpose, DNA was extracted from Bacillus sp. T5S-T4 and Bacillus sp. 19RS3, and their genomes were sequenced, assembled, and annotated. From the gyrB gene sequences and the concatenation of the 16S-23S-gyrB sequences, both strains were identified as B. altitudinis T5S-T4 and B. altitudinis 19RS3. The assembled and annotated genomes were deposited in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database under accession numbers JACAAI01 and JACAAH01, respectively. Based on the annotations obtained, the genes responsible for plant growth promotion through direct and indirect mechanisms were detected and characterized. To verify the biofertilizing effect of the strains, a traceability test was carried out in the nursery, from organic I. paraguariensis St. Hil. seedlings inoculated with B. altitudinis T5S-T4, B. altitudinis 19RS3, the combination of both strains (B. altitudinis T5S-T4 + B. altitudinis 19RS3) and a negative control. Measurements of the growth parameters height, number of leaves, neck diameter and chlorophyll index were made every 15 days. Once the trial was finished, the seedlings were processed in the laboratory and the fresh and dry weights of the total aerial part, leaves and roots, and leaf area were measured. Statistical analysis of all measured growth parameters was performed. The bioinoculant effect of the combination of both strains was verified from the significant increase in growth parameters: height, neck diameter, chlorophyll index, and fresh weight of the aerial part. To verify the colonization and persistence of both strains, a manual search for unique sequences in both genomes was carried out for the design of strain-specific primers. Their specificity was verified in silico and in vitro and the polymerase chain reaction (PCR) technique was optimized. The B. altitudinis T5S-T4 and B. altitudinis 19RS3 strains were detected on the substrate, from day 14 and 28 from first inoculation, respectively, until day 112 of the assay. Only the strain B. altitudinis T5S-T4 strain was detected in roots inoculated under germination chamber conditions. Based on the results obtained, the properties exerted by B. altitudinis T5S- T4 and B. altitudinis 19RS3 in a consortium make them excellent candidates for the future generation of a new bioinoculant for I. paraguariensis St. Hil.