Cascarilla de arroz : obtención de bioetanol a partir de la hidrólisis y fermentación simultánea

Abstract

Debido al agotamiento de combustibles fósiles y la situación mundial frente a la problemática de producción de biocombustibles sostenibles y amigables con el medio ambiente, se han propuesto alternativas para el aprovechamiento de biomasas y la generación de productos de alto valor agregado. Actualmente los biocombustibles que han sido industrializados y explotados son los combustibles obtenidos principalmente de biomasas como la caña de azúcar y el maíz, en el caso del bioetanol. La problemática que presenta la producción de estos biocombustibles radica en la gran cantidad de hectáreas de estas materias primas (caña de azúcar, maíz) que tienen que ser cultivadas para suplir las necesidades alimenticias y energéticas de la sociedad, por esta razón son denominados combustibles de primera generación. Debido a lo anterior, la utilización de biomasas producidas por actividades agro-industriales, como paja de arroz, cascarilla de arroz, paja de cebada, paja de trigo, entre otras, ha despertado interés. Estos residuos pueden ser utilizados para la obtención de biocombustibles, como el bioetanol. Estas biomasas presentan gran cantidad de celulosa seguida por hemicelulosas y lignina. El aprovechamiento de la celulosa y hemicelulosas permitiría la obtención de azúcares fermentables, de los que se obtendría finalmente el bioetanol. El objetivo general de esta tesis, se centra en la producción de bioetanol de cascarilla de arroz por hidrólisis y fermentación simultánea (Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF), utilizando el proceso de hidrólisis seguida de fermentación (Separated Hydrolysis and Fermentation, SHF) como referencia. Se propuso el aprovechamiento de la cascarilla de arroz para producción de bioetanol, teniendo en cuenta que es un residuo que se produce en grandes proporciones en el NEA Argentino, debido a la actividad industrial de varias arroceras ubicadas en esta región donde se desarrolló este trabajo. En este trabajo se realizaron ensayos preliminares de hidrólisis y fermentación simultánea (SSF), utilizando cascarilla de arroz pretratada en condiciones severas, para eliminar hemicelulosas y lignina. Inicialmente se llevó a cabo el pretratamiento con ácido sulfúrico diluido a 150°C durante 30 minutos para remover las hemicelulosas, seguidamente se realizó un tratamiento con NaOH a 160°C durante 1 h para remover lignina. También se aplicó una secuencia con ácido diluido para remover hemicelulosas seguida por un pretatamiento organosolv, utilizando NaOH como catalizador y etanol como solvente a 170°C durante 1 h para remoción de lignina. Estos pretratamientos fueron optimizados previamente en el Centro de Investigación en Química Orgánica Biológica QUIMOBI, UTN Resistencia, Argentina. La cascarilla pretratada con la secuencia ácido diluido-tratamiento alcalino, fue utilizada como sustrato en el proceso SSF. La hidrólisis enzimática se efectuó con las celulasas de Trichoderma reesei suplementada con celobiasa de Aspergillus niger de Sigma Aldrich, con un dosaje enzimático de 40 FPU/g glucano, y se evaluó la producción de etanol con diferentes microorganismos, tales como Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Candida tropicalis, Candida guilliermondii, donados por el cepario del Hospital Malbrán de la ciudad de Buenos Aires. Las experiencias se realizaron a 35 °C y hasta 10 días. Los resultados de producción de bioetanol de este ensayo preliminar de SSF fueron 64,74% para S. cerevisiae, 75,98% para K. marxianus, 7,79% para C.tropicalis y 2,10% para C. guilliermondii. El ensayo se operó durante 10 días, pero la mayor producción de bioetanol por parte de los microorganismos se observó dentro de los primeros 4 días de proceso. Sobre la base de los resultados obtenidos en el ensayo preliminar del proceso simultáneo y teniendo en cuenta que las enzimas celulasas hidrolizan a temperaturas entre 40°C - 50°C, pero los microorganismos fermentan hasta temperaturas de 37°C, máximo 40°C en el caso de K. marxianus, se optó por encontrar una temperatura intermedia en donde tanto los microorganismos como las enzimas trabajaran correctamente. Se optimizó el proceso de hidrólisis enzimática con la utilización de las enzimas Cellic CTec2, que fueron donadas por Novozymes, Brasil. Se realizó este cambio en las enzimas utilizadas en el proceso debido a que las enzimas utilizadas anteriormente (de Sigma Aldrich), disminuían su actividad enzimática muy rápidamente. También se utilizó otro tipo de pretratamiento de la cascarilla para llevar a cabo la optimización de la hidrólisis enzimática. Se optó por utilizar pretratamiento con NaOH, 10% (p/v) biomasa, 3% (p/v) de NaOH, durante 1 h a 121°C en autoclave, ya que este tipo de pretratamiento presenta condiciones menos severas y utiliza equipamiento más accesible, con la posibilidad de aprovechar los productos obtenidos en una biorrefinería. Para la optimización de la hidrólisis enzimática se utilizaron dos tipos de diseños experimentales. Inicialmente se desarrolló un diseño de cribado utilizando las variables FPU/g sustrato, pH, tiempo (h), temperatura (°C), agitación (rpm) y concentración de surfactante (g/L), en el cual todas las variables resultaron significativas, excepto la agitación. Para el segundo diseño se optó por las variables FPU/g sustrato, pH, y tiempo (h), manteniendo fija la agitación (180 rpm), la temperatura (37°C) y la concentración de surfactante (0,3 g/L), se utilizó una concentración de sólidos del 2 % (p/v). Los resultados del diseño de optimización indicaron que el máximo rendimiento de azúcares obtenido fue de aproximadamente 62%, con 50 FPU/g glucanos, a las 13 h de reacción y pH ~ 4,9. Se realizaron ensayos posteriores con menor carga enzimática y aumentado el porcentaje de sólidos. En los ensayos se utilizaron 6%, 8% y 10% de celulosa hidrolizable, 30 FPU/g glucanos, pH 5,0 y un tiempo de reacción de 13 h, se obtuvieron rendimientos de hidrólisis de 51,11%, 29,92% y 11,07% respectivamente. Posteriormente se utilizó 2% (p/v) de cascarilla molida y sin moler en los ensayos, pero se observó que no existen diferencias significativas entre los resultados obtenidos con los dos tipos de cascarilla. Los resultados obtenidos de la hidrólisis enzimática fueron 41,16% de azúcares reductores y 36,60% de glucosa en el caso de cascarilla molida, 37,70% de azúcares reductores y 35,50% glucosa para la cascarilla sin moler. Por último, se compararon los procesos fermentativos SSF y SHF, con la levadura S. cerevisiae 1181. El proceso SSF se realizó con un dosaje enzimático de 30 FPU/g glucanos de las enzimas Cellic CTec2, 2% (p/v) de cascarilla de arroz, 37°C, 130 rpm, durante 72 h, presentando un rendimiento de producción de bioetanol de 38%, con la mayor producción de bioetanol dentro de las primeras 49 h. En el proceso SHF se utilizaron las mismas condiciones de trabajo que el proceso simultáneo, con 13 h de hidrolisis y 13 h de fermentación se obtuvo 35% de producción de bioetanol, totalizando 26 h de proceso. Comparando con el proceso SHF, en el proceso SSF se obtuvo un rendimiento superior, aunque en mayor tiempo. Por otra parte, el proceso SSF ofrece menor grado de contaminación, se realiza en un solo reactor y presenta menos compuestos inhibitorios en el medio de fermentación. En el caso de SHF se produce una acumulación de compuestos que pueden llegar a inhibir la actividad fermentativa de los microorganismos. Buscando mejorar el rendimiento, se realizó un proceso SSF con la levadura S. cerevisiae 1507, con una duración de 24 h, presentando un rendimiento de bioetanol de 44%. A diferencia de la levadura S. cerevisiae 1181, este microorganismo presentó mayor rendimiento de producción de bioetanol en menor tiempo. Según los resultados obtenidos en el desarrollo de esta tesis, se concluye que es posible obtener bioetanol a partir de cascarilla de arroz mediante el proceso SSF aplicando pretratamientos severos y suaves, por lo que es motivador continuar el estudio de este proceso para mejorar la obtención de este biocombustible.

Due to the depletion of fossil fuels and the world situation facing the problem of sustainable and environmentally friendly biofuel production, alternatives have been proposed for the use of biomass and the generation of high added-value products. Currently, the biofuels that have been industrialized and exploited are fuels obtained mainly from biomass such as sugar cane and corn, in the case of bioethanol. The problem with the production of these biofuels lies in a large number of hectares of these raw materials (sugar cane, corn) that have to be cultivated to supply the food and energy needs of society, for this reason, they are called fuel first generation. Due to the above, the use of biomass produced by agro-industrial activities, such as rice straw, rice husk, barley straw, wheat straw, among others, have aroused interest. These residues can be used to obtain biofuels, such as bioethanol. These biomasses have a large amount of cellulose, followed by hemicelluloses and lignin. The use of cellulose and hemicelluloses would allow obtaining fermentable sugars, and finally bioethanol. The general objective of this thesis focuses on the production of bioethanol from rice husk by hydrolysis and simultaneous fermentation (Simultaneous Saccharification and Fermentation, SSF), using the hydrolysis followed by fermentation process (Separated Hydrolysis and Fermentation, SHF) as a reference. The use of rice husk for the production of bioethanol was proposed, taking into account that it is a waste produced in large proportions in the NEA region of Argentine, due to the industrial activity of several rice plants located where this work was developed. In this work, preliminary tests of hydrolysis and simultaneous fermentation (SSF) were carried out with pretreatments under severe conditions to eliminate hemicelluloses and lignin. Initially, pretreatment was carried out with dilute sulfuric acid at 150°C for 30 minutes to remove the hemicelluloses, followed by treatment with NaOH at 160°C for 1 hour to remove lignin. A dilute acid sequence was also applied to remove hemicelluloses followed by an organosolv pretreatment, using NaOH as catalyst and ethanol as solvent at 170°C for 1 h to remove lignin. These pretreatments were previously optimized at the QUIMOBI Biological Organic Chemistry Research Center, UTN Resistencia, Argentina. The scale pretreated with the dilute acid-alkaline treatment sequence was used as a substrate in the SSF process. Enzymatic hydrolysis was carried out with Trichoderma reesei cellulases supplemented with Aspergillus niger cellobiase from Sigma Aldrich, with an enzymatic dosage of 40 FPU/ g glucan, and ethanol production was evaluated with different microorganisms, such as Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces marxianus, Candida tropicalis, Candida guilliermondii, donated by the hospital Malbrán Hospital in the city of Buenos Aires. The experiments were carried out at 35 °C and up to 10 days. The bioethanol production results from this preliminary SSF trial were 64,74% for S. cerevisiae, 75,98% for K. marxianus, 7,79% for C. tropicalis, and 2,10% for C. guilliermondii. The test lasted for 10 days, but the highest production of bioethanol by microorganisms was observed within the first 4 days of the process. Based on the results obtained in the preliminary test of the simultaneous process and taking into account that cellulase enzymes hydrolyze at temperatures between 40°C - 50°C, but the microorganisms ferment up to temperatures of 37 ° C, maximum 40 ° C in the case of K. marxianus, it was decided to find an intermediate temperature where both microorganisms and the enzymes worked correctly. The enzymatic hydrolysis process was optimized with the use of Cellic CTec2 enzymes, which were donated by Novozymes, Brazil. This change was made in the enzymes used in the process because the enzymes used previously (from Sigma Aldrich), decreased their enzymatic activity very quickly. Another type of scale pretreatment was also used to carry out the optimization of the enzymatic hydrolysis. It was decided to use pretreatment with NaOH, 10% (w/v) biomass, 3% (w/v) NaOH, for 1 h at 121 °C in an autoclave, since this type of pretreatment presents less severe conditions and uses equipment more accessible, with the possibility of taking advantage of the products obtained in a biorefinery. For the optimization of enzymatic hydrolysis, two types of experimental designs were used. Initially, a screening design was developed using the variables FPU / g substrate, pH, time (h), temperature (°C), agitation (rpm) and surfactant concentration (g/L), in which all the variables were significant except agitation. For the second design, the variables FPU/g substrate, pH, and time (h) were chosen, keeping constant the stirring (180 rpm), temperature (37 °C) and surfactant concentration (0,3 g / L), solids concentration of 2% (w/v) was used. The results of the optimization design indicated that the maximum sugar yield obtained was approximately 62%, with 50 FPU/g glucan, at 13 h of reaction and pH ~ 4.9. Subsequent tests were carried out with a lower enzyme load and an increased percentage of solids. The trials used 6%, 8% and 10% of hydrolyzable cellulose, 30 FPU/g glucan, pH 5,0 and reaction time of 13 h, hydrolysis yields of 51,11%, 29,92% and 11,07% respectively, were obtained. Subsequently, 2% (w/v) of ground and unmilled husk was used in the tests, but it was observed that there are not significant differences between the results obtained with the two types of husk. The results obtained from the enzymatic hydrolysis were 41,16% reducing sugars and 36,60% glucose in the case of ground husk, 37,70% reducing sugars and 35,50% glucose for the raw husk. Finally, the fermentative processes SSF and SHF were compared with the yeast S. cerevisiae 1181. The SSF process was carried out with an enzymatic dosage of 30 FPU/g glucan of the Cellic CTec2 enzymes, 2% (w/v) of husk of rice, 37 °C, 130 rpm, for 72 h, presenting a bioethanol production yield of 38%, with the highest bioethanol production within the first 49 h. In the SHF process the same working conditions were used as the simultaneous process, with 13 h of hydrolysis and 13 h of fermentation, 35% of bioethanol production was obtained, totaling 26 h of process. Comparing with the SHF process, in the SSF process a higher performance was obtained, although in a longer time. On the other hand, the SSF process offers a lower degree of contamination, is carried out in a single reactor and has fewer inhibitory compounds in the fermentation medium. In the case of SHF, there is an accumulation of compounds that can inhibit the fermentative activity of microorganisms. Seeking to improve the yield, an SSF process was carried out with the yeast S. cerevisiae 1507, with a duration of 24 h, presenting a bioethanol yield of 44%. Unlike the yeast S. cerevisiae 1181, this microorganism presented a higher yield of bioethanol production in less time. According to the results obtained in the development of this thesis, it is concluded that it is possible to obtain bioethanol from rice husk through the SSF process applying severe and mild pretreatments, so it is motivating to continue the study of this process to improve the obtaining of this biofuel.