Variabilidad del gen latent membrane protein 1 (LMP1) del virus Epstein-Barr en el linfoma de Hodgkin : estudios moleculares y filogenéticos

Abstract

VARIABILIDAD DEL GEN latent membrane protein 1 (LMP1) DEL VIRUS EPSTEIN-BARR EN EL LINFOMA DE HODGKIN: ESTUDIOS MOLECULARES Y FILOGENETICOS INTRODUCCION: El virus Epstein-Barr esta involucrado en la patogénesis del linfoma de Hodgkin (LH), exhibiendo un programa de latencia II caracterizado por la expresión de los genes EBER,s EBNA1, LMP1 y LMP2. La proteína LMP1 es considerada el principal oncogén viral, presentando alta variabilidad molecular, Principalmente en su región C-terminal (C-ter). El objetivo de este trabajo fue estudiar la variabilidad molecular del LMP1 en aislamientos de LH para identificar polimorfismos génicos que podrían contribuir al potencial oncogénico del virus y servir como marcadores epidemiológicos. MATERIALES Y METODOS: Fueron estudiados 71 casos con LH y 40 controles no neoplásicos (CNN). El EBV fue detectado por PCR e hibridización in situ (EBER-ISH) y la expresión de LMP1 fue detectada por inmunohistoquímica (IHQ) y RT-PCR. La asociación con EBV fue identificada en 34 casos de LH y 11 CNN. La tipificación (EBV-1 y EBV-2) fue realizada por PCR para el gen EBNA2. PCR específicas fueron utilizadas para detectar la presencia de una deleción de 30 pb (del30) y el número de repeticiones de 33 pb en la región C-ter de LMP1. La pérdida del sitio de restricción XhoI (exón 1) fue determinada por RFLP-PCR. Fueron amplificados un fragmento del promotor (nt -217 a +1), de la región N-ter (nt 1-137) y de la región C-ter (aa 232-370), seguido de secuenciación. Árboles filogenéticos fueron construidos a partir de matrices de distancia, usando el método de “Neighbor Joining”. RESULTADOS: La variante del30 fue encontrada en 20/35 LH y 3/11 CNN. La presencia de la variante del30 mostró una tendencia de asociación con el LH (p = 0,15, Test de Fisher). La mayoría (94%) de las variantes del30 mostraron también un número mayor de de repeticiones de 33pb (5 a 7), cuando comparadas con el alelo salvaje (p<0,0001, Test de Fisher), sugiriendo que fenómenos activos de recombinación pueden estar jugando un papel en la variabilidad de la región C-ter. El sitio de restricción XhoI fue retenido en el 64% de los casos. La pérdida y/o retención del sitio XhoI, no demostró asociación significativa con los marcadores moleculares y secuencias. El análisis de las secuencias C-ter mostró que las variantes salvajes (N=20) presentaron 4 patrones moleculares, incluyendo secuencias relacionadas filogenéticamente con el prototipo B95.8 (35%). Fue notoria la ausencia de variantes altamente mutadas del tipo D/CAO. En las secuencias de variantes del30 (N=13), el grupo C europeo fue el mas representado. Una inserción de 15 pb (ins15) (aa 276-280) presente en secuencias filogenéticamente asociadas a B95.8/A (alelo salvaje), fue observada en 10/13 secuencias del30 vs 3/13 secuencias salvajes (p=0,01, χ2 = 5,54). Estos resultados sugieren selección positiva de las variantes ins15/del30 en la región sudeste de Brasil. El análisis de las secuencias del promotor de LMP1, mostró un 41% de los aislamientos sin mutaciones recurrentes, mientras que el 59% restante presentó mutaciones recurrentes similares a las observadas en la variante africana Raji, europea D y asiática CAO, así como mutaciones no descriptas previamente. El análisis conjunto de las diferentes regiones del gen LMP1 permitió realizar tres grupos: (I) promotor sin mutaciones (excepto por -158 C>T), asociado a regiones N y C-ter B95.8/A y B (41%) (II) promotor con mutaciones compartidas D/CAO/Raji, asociado a C-ter del30 (12%) (III) promotor similar a la variante Raji pero con C-ter del30 (47%) En el promotor, el sitio ATF/CREB (-45 a -38), potente activador de la expresión, fue encontrado mutado en todos los casos de los grupos II y III, descartando selección negativa de estas variantes. El análisis filogenético del promotor agrupó los aislamientos brasileños, separándolos de las variantes asiáticas y D europea, así como respaldó la clasificación de los grupos I – III propuesta. Discordancias entre los árboles inferidos a partir de las secuencias del promotor y de C-ter son probablemente debidas a la fijación de una variante recombinante. CONCLUSIONES: Este trabajo es la primera descripción de promotores del gen LMP1 en aislamientos de EBVs circulantes de América del Sur y permitió describir la variabilidad presente en el gen LMP1 en casos de LH y CNN EBV+ de la región Sudeste de Brasil, así como realizar inferencias filogenéticas y patogénicas. Los resultados sugieren que las secuencias del promotor y de C-ter de LMP1 podrían ser adecuadas para el estudio de la evolución del EBV en relación a las migraciones humanas, así como para estudios epidemiológicos. Estudios futuros podrán dilucidar la prevalencia, diferencias en la actividad biológica y potencial oncogénico de las variantes descriptas.